血管紧张素Ⅱ调控基质金属蛋白酶MMP-2的表达在升主动脉瘤发病中的机制研究

发布时间：2018-03-19 12:17

本文选题：升主动脉瘤　切入点：主动脉瓣二瓣化　出处：《北京协和医学院》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景和目的胸主动脉瘤是指胸主动脉扩张并且直径超过正常值的1.5倍。大部分位于升主动脉,称之为升主动脉瘤(aneurysmal aortic thoracic aneurysm, ATAA)。主动脉瓣二瓣化畸形(Bicuspid Aortic Valve, BAV)是最常见的先天性心脏病,发病率高达1-2%。相比主动脉瓣三叶瓣(Tricuspid Aortic Valve, TAV)的升主动脉瘤患者,BAV患者发生升主动脉瘤的几率和风险明显增高。最近,基因和蛋白组学的研究结果表明主动脉瓣二瓣化畸形畸形和正常的三叶瓣膜伴发升主动脉瘤的病理机制是不相同的。有研究表明基质蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)尤其是主动脉中层的平滑肌分泌的MMP-2在ATAA中表达明显增高,增高的MMP-2降解细胞外基质如弹力和胶原纤维,破坏主动脉壁的正常结构和升主动脉在血流动力学作用下进行性扩张,从而诱发ATAA产生。然而MMP-2在BAV和TAV伴发的ATAA表达不清楚并且主动脉壁中的MMP-2升高的分子和细胞机制也不清楚。有研究表明ERK1/2, JNK及磷酸化水平在腹主动脉瘤中升高,而涉及腹主动脉瘤形成与进展。然而丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路是否涉及胸主动脉瘤的发病,未见到相关报道。并且MAPK信号通路在ATAA的BAV和TAV亚型的表达是否有差异更是未见报道。当前越来越多的临床试验和动物实验的证据表明AngⅡ参与了胸主动脉瘤的形成和进展,除了AngⅡ外,肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)其他成分血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)血管紧张素受体(angiotensin type receptor, ATR)等也被涉及胸主动脉的发病机制。当前研究存在一些问题,如样本量过小,病例数大多在个位数,集中在结缔组织病相关的ATAA研究上,而对非结缔组织相关的ATAA的研究鲜有报道,而且研究只是限于RAS的某一种成分,尚缺乏较为全面的研究RAS在ATAA的表达的报道。Wang等研究者表明在大鼠的颈动脉中AngⅡ能够诱导大鼠的颈动脉表达MMP-2增加。在大鼠胸主动脉平滑肌细胞,人视网膜上皮细胞,和人脐静脉内皮细胞中,MAPK信号通路被报道参与AngⅡ介导的MMP-2表达。然而在人胸主动脉瘤平滑肌细胞中,AngⅡ是否也能上调MMP-2表达,MAPK通路是否涉及该过程还未阐明。本实验旨在通过临床组织标本,分析ATAA及其BAV和TAV亚型的病理学和分子学特征,探讨MMP-2, MAPK, RAS在ATAA及其BAV和TAV亚型的表达,寻求BAV高发ATAA可能的原因。在细胞学和组织学水平探明Ang Ⅱ, MMP-2与MAPK之间的联系,并提出其可能的分子机制,为ATAA的预防与治疗提供理论支持。研究方法与结果为实现上述目的,我们进行了如下四部分实验。1.第一部分基质金属蛋白酶MMP-2在主动脉瓣二瓣化畸形膜畸形与三叶瓣膜伴发升主动脉瘤中的表达研究。我们选取2013年2月至2014年10月在中国医学科学院阜外心血管病医院血管外科中心住院的升主动脉瘤患者,20例TAV患者,20例BAV患者；排除结缔组织主动脉疾病(Marfan综合症,Loeys-Dietz综合症,Ehler-Danlos综合症)、家族性主动脉瘤、炎症性主动脉疾病、感染性主动脉疾病,梅毒性主动脉疾病,外伤性主动脉疾病。在外科手术切除升主动脉时获取标本。对照组来自20例同期住院的无升主动脉疾患的冠心(coronary heart diseases, CHD)患者,在行冠状动脉旁路移植术时获取升主动脉与大隐静脉吻合时打孔取下的升主动脉壁,还有5例心脏移植器官供体的升主动脉。通过HE染色和弹力纤维EVG染色,观察5例BAV患者,5例BAV患者,5例心脏移植供体的主动脉壁平滑肌细胞,炎症细胞浸润,弹力纤维,胶原纤维等情况。运用蛋白免疫印迹Western blot及荧光定量PCR技术研究MMP-2在ATAA的表达；从瓣膜和主动脉两个水平去研究MMP-2表达在BAV和TAV伴发升主动脉瘤患者之间的差异。我们的结果发现TAV合并的ATAA的升主动脉中层可见到严重的弹力纤维断裂,数量减少和大量的胶原纤维聚集,大量的平滑肌细胞减少和内、外、中膜都可见明显的炎症细胞浸润,而对照组和TAV合并的ATAA的升主动脉的内膜和中层表现了完整和有序的弹力纤维,少量的胶原纤维；中层见到均匀的分布于主动脉中层平滑肌细胞,动脉的各层未见有炎症细胞。在基因转录和蛋白翻译水平,相比对照组的正常升主动脉,BAV和TAV患者的升主动脉壁中MMP-2表达明显升高,进一步在BAV患者,MMP-2蛋白表达也明显高于TAV患者。MMP-2的在BAV和TAV瓣膜组织之间的表达也是有差异的,与在主动脉组织的结果是一致的。BAV和TAV患者的血浆中MMP-2含量高于CHD患者,而在BAV和TAV患者之间血浆中MMP-2无统计学差异。2.第二部分丝裂原活化蛋白激酶MAPK在主动脉瓣二瓣化畸形畸形与三叶瓣膜合并升主动脉瘤的表达研究。我们选取的病例组和对照组主动脉标本同第一部分。利用Western blot技术对MAPKs分子在升主动脉瘤及在BAV和TAV亚型中的表达情况进行了相关研究。我们的结果发现p-JNK和t-JNK蛋白表达及p/t-JNK水平在BAV和TAV伴发的升主动脉瘤中升高,p54JNK蛋白及其磷酸化水在BAV患者升主动脉的表达要高于TAV患者,然而在瓣膜组织TAV患者JNK却明显高于BAV患者。P-ERK1/2, t-ERK1/2及p/t-ERK1/2水平在CHD,BAV,TAV患者的升主动脉中表达无统计学差异,然而在瓣膜组织可见到TAV患者的t-ERK1/2蛋白水平明显高于BAV患者。t-p38MAPK蛋白表达在BAV和TAV患者升主动脉中升高,相比CHD对照组的正常的升主动脉。并且TAV患者升主动脉的t-p38MAPK蛋白水平也高于BAV组。但在瓣膜组,两者并无统计学差异。p38MAPK磷酸化水平在BAV和TAV患者的升主动脉中并不高。然而相比BAV组,TAV组p-p38MAPK是明显升高的。进一步,在瓣膜组织,BAV和TAV组p-p38MAPK水平是没有统计学差异的。p/t-p38MAPK在CHD, BAV, TAV患者的升主动脉和瓣膜组织中表达均无统计学差异。3.第三部分肾素-血管紧张素系统RAS在升主动脉瘤的表达。我们选取40例升主动脉瘤组织标本,取自2013年2月至2013年12月在中国医学科学院阜外心血管病医院血管外科中心手术切除的升主动脉瘤壁。经术前心脏超声或主动脉CT确定升主动脉最大直径中位数5.1cm (4.5-6.6cm)。对照组的正常升主动脉来自40例同期的冠心病(coronary heart diseases, CHD)患者,在阜外心血管病医院血管外科中心行冠状动脉旁路移植术时升主动脉与大隐静脉吻合时打孔取下的升主动脉壁,5例心脏移植器官供者的升主动脉。排除结缔组织主动脉疾病(Marfan综合症,Loeys-Dietz综合症,Ehler-Danlos综合症)、家族性主动脉瘤、主动脉瓣二瓣化畸形、炎症性主动脉疾病、感染性主动脉疾病,梅毒性主动脉疾病,外伤性主动脉疾病；利用蛋白免疫印迹Western blot,放射免疫法RIA和免疫荧光技术对局部RAS主要成分在非马凡特发性的升主动脉瘤的表达情况进行了研究。我们的结果发现相比CHD患者,血管紧张素原AGT的表达、AngⅡ的水平、血管紧张素转化酶ACE的活性在ATAA患者的升主动脉中升高。而且,血浆中AngⅡ含量ATAA患者也高于CHD患者。4.第四部分血管紧张素II促进基质金属蛋白酶MMP-2在升主动脉瘤平滑肌细胞中表达的机制研究。我们通过体外培养患者的升主动脉瘤组织块及升主动脉瘤的平滑肌细胞和正常胸主动脉的平滑肌细胞,去弄清升主动脉瘤中MMP-2增高的机制,探究Ang Ⅱ, MAPK, MMP-2在升主动脉瘤发病中的联系。我们的结果发现在体外培养的患者的升主动脉瘤组织块及升主动脉瘤的平滑肌细胞和正常胸主动脉的平滑肌细胞中,AngⅡ均呈现了以浓度和时间依赖方式促MMP-2的表达。AngⅡ能够诱导升主动脉瘤的平滑肌细胞的JNK, ERK1/2, p38 MAPK磷酸化水平。而在正常胸主动脉的平滑肌细胞中,只见到AngⅡ诱导ERK1/2磷酸化,而未见到JNK和p38 MAPK发生磷酸化。AngⅡ通过血管紧张素Ⅱ受体1诱导MMP-2表达上调及MAPK分子磷酸化。AngⅡ通过激活JNK, ERK1/2, p38 MAPK通路诱导升主动脉瘤平滑肌细胞表达MMP-2,而在正常胸主动脉的平滑肌细胞中,只有ERK1/2通路参与该过程。结论1.MMP-2表达增加是升主动脉瘤发病的重要因素。2.主动脉瓣膜二瓣化相对高发胸主动脉瘤可能与瓣膜及升主动脉MMP-2表达增加有关。3.JNK的激活可能涉及升主动脉瘤形成。4.BAV和TAV伴发的ATAA有不同的MAPK分子的表达和激活,表明两者可能涉及不同的MAPK分子机制。5.BAV伴发的ATAA的p54JNK水平的增高可能有助于解释BAV伴发的ATAA高的MMP-2水平。6.TAV伴发的ATAA的升主动脉壁病理改变要比BAV重。7.RAS参与了ATAA的发病过程。8. Ang Ⅱ能够诱导升主动脉瘤平滑肌细胞MMP-2表达上调,这可能是ATAA MMP-2表达上调的重要原因,9.ARB药能够抑制AngⅡ诱导的ATAA平滑肌细胞的MMP-2表达上调,这为ARB药物治疗ATAA提供了理论基础。10. MAPK抑制剂可抑制AngⅡ能够诱导ATAA平滑肌细胞MMP-2表达上调,这提示MAPK抑制剂可能有助于ATAA的预防和治疗。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R654.2

【共引文献】