融合蛋白CTP-FoxM1对小鼠骨髓来源树突状细胞免疫活化作用的初步研究

发布时间：2017-12-28 16:27

  本文关键词：融合蛋白CTP-FoxM1对小鼠骨髓来源树突状细胞免疫活化作用的初步研究　出处：《重庆医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的：初步探讨融合蛋白CTP-FoxM1对小鼠骨髓来源DCs的免疫活化作用,为探索其是否能够在体内发挥免疫效应奠定基础。方法：(1)无菌条件下分离小鼠骨髓来源的细胞,红细胞裂解液裂解红细胞后,GM-CSF联合IL-4体外诱导培养细胞至第7d,光镜下观察细胞的形态,流式细胞术分析检测细胞表面分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表达情况,ELISA法检测细胞培养上清中IL-12的释放水平,MLR检测细胞刺激同种异体淋巴细胞的能力。(2)融合蛋白CTP-FoxM1、CTP、FoxM1分别作用DCs 48h后,CCK-8试剂盒检测其存活率,流式细胞术检测其表面分子表达情况,ELISA法检测其培养上清中IL-12的分泌水平。(3)DCs经融合蛋白CTP-FoxM1、CTP、FoxM1作用48h后,与小鼠脾脏来源的CD8+T细胞共同培养72h, ELISA试剂盒检测上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌情况。结果：(1)从每只小鼠的骨髓可获得约3×107个细胞,光学显微镜下可见细胞伸出“树枝状”突起,经流式细胞仪检测,细胞表面标志性分子CD11c表达量为88±4.66%,与未经LPS刺激的细胞相比,经LPS刺激的细胞表面分子表达量明显增高(P0.001),其培养上清中的IL-12水平增高(P0.001)。结果表明通过该方法成功获得较高纯度的DCs。MLR实验显示经DCs作用后的T细胞其增殖率明显较未经DCs作用的T细胞高(P0.01),表明经该方法分离诱导培养的DCs具有较强的刺激T淋巴细胞增殖的能力。(2) CTP-FoxM1对DCs的存活有抑制作用,且在一定范围内与浓度呈正相关。与蛋白CTP、FoxM1相比,CTP-FoxM1可明显上调DCs表面分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表达量(P0.001),促进DCs培养上清中IL-12的分泌(P0.001)。(3)将融合蛋白CTP-FoxM1、CTP、FoxM1抗原负载的DCs与CD8+T淋巴细胞共培养,CTP-FoxM1组上清液中细胞因子IFN-γ、 TNF-α的分泌量较CTP组(P0.001,P0.001)和FoxM1组高(P0.001,P0.01)。结论：(1)经本实验室改进,红细胞裂解法能够分离出纯度较高的DCs,可以满足后续实验；(2)融合蛋白CTP-FoxM1能够上调DCs表面分子表达,诱导IL-12分泌,具有免疫活化DCs的潜能。(3) CTP-FoxM1作用后的DCs与CD8+T淋巴细胞共培养后,其上清IFN-γ、TNF-α分泌水平显著上调,提示CTP-FoxM1可能具有诱导DCs发挥抗原交叉递呈功能,介导CD8+T淋巴细胞发挥CTL免疫应答的潜能。
[Abstract]:Objective: to preliminarily explore the immune activation effect of fusion protein CTP-FoxM1 on mouse bone marrow derived DCs, and lay a foundation for exploring whether it can play an immune role in vivo. Methods: (1) isolated from mouse bone marrow cells under aseptic conditions, red blood cell lysis of red blood cells, cultured cells to the 7d GM-CSF and IL-4 in vitro, the cell morphology was observed under the light microscope, the expression analysis of cell surface marker CD40 and CD80, CD86 and MHC- with flow cytometry. The release level of supernatant of IL-12 cells was detected by ELISA MLR detection of cell culture, the ability to stimulate allogeneic lymphocytes. (2) after fusion protein CTP-FoxM1, CTP and FoxM1 acted on DCs 48h respectively, the survival rate of CCK-8 was detected by CCK-8 kit. The expression of surface molecules was detected by flow cytometry. The secretion level of IL-12 in the culture supernatant was detected by ELISA. (3) after DCs was treated with fusion protein CTP-FoxM1, CTP and FoxM1 for 48h, 72h was co cultured with mouse spleen derived CD8+T cells, and ELISA kit was used to detect the secretion of IFN- gamma and TNF- alpha in the supernatant. Results: (1) from each mouse bone marrow can be approximately 3 x 107 cells under light microscope, cells extended dendritic protrusions by flow cytometry, cell surface markers of CD11c expression was 88 + 4.66%, compared with the untreated LPS cells stimulated by cell surface molecular stimulation of LPS expression were increased (P0.001), the culture supernatant of elevated levels of IL-12 (P0.001). The results show that the high purity DCs is successfully obtained by this method. MLR test showed that the proliferation rate of T cells after DCs treatment was significantly higher than that of T cells without DCs (P0.01), indicating that the isolation and culture of DCs induced by this method had strong ability to stimulate T lymphocyte proliferation. (2) CTP-FoxM1 has a inhibitory effect on the survival of DCs, and has a positive correlation with the concentration in a certain range. Compared with protein CTP and FoxM1, CTP-FoxM1 significantly increased the expression of DCs surface molecules CD40, CD80, CD86 and MHC- II (P0.001), and promoted the secretion of IL-12 in DCs culture supernatant (P0.001). (3) co culture of DCs loaded with fusion protein CTP-FoxM1, CTP and FoxM1 antigen and CD8+T lymphocytes. The secretion of cytokine IFN- IFN- and TNF- alpha in CTP-FoxM1 group supernatant was higher than that in CTP group (P0.001, P0.001) and CTP group. Conclusion: (1) through the improvement of our laboratory, the red cell lysis method can isolate DCs with high purity, which can meet the following experiments. (2) fusion protein CTP-FoxM1 can upregulate the expression of DCs surface molecules and induce IL-12 secretion, and has the potential to activate DCs by immunization. (3) after the co culture of DCs and CD8+T lymphocytes after CTP-FoxM1, the level of IFN- gamma and TNF- alpha secretion was significantly up-regulated, suggesting that CTP-FoxM1 may have the potential to induce DCs to play the function of antigen cross delivery, and mediate CD8+T lymphocytes to play the potential of CTL immune response.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.6

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本文编号：1346577