红细胞冻干保存影响因素的初步研究

发布时间：2017-12-30 02:27

本文关键词：红细胞冻干保存影响因素的初步研究　出处：《北京协和医学院》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：红细胞长期保存是输血医学中的重要研究课题,冻干法是实现红细胞长期保存的方法之一。早在上世纪60年代,就有学者尝试以冻干的方式保存红细胞。至上世纪90年代,红细胞的冻干保存成为低温生物医学研究的热点,国内外的数个研究小组对冻干保护剂的筛选和冻干、复水过程等环节进行了大量的研究。在此过程中,发现冻干的红细胞总有一部分水难以去除,将这部分水定义为“残余水分”。残余水相关问题是目前红细胞冻干保存研究遇到的争议和瓶颈之一。近年来,发现甘油作为渗透性保护剂,进入细胞内与细胞蛋白、脂质形成氢键,降低了电解质的浓度,减少了胞内冰的形成,与PVP等非渗透性的保护剂联合使用,保护效果较好。但是甘油有保湿护水作用,不利于干燥,这与去除水分又相矛盾,可见对于保护剂中甘油与残余水的问题还有很多工作去做。本研究在课题组前期工作的基础上对红细胞冻干保护剂中甘油浓度及与残余水的关系、冻干红细胞残余水含量测定方法等问题进行了初步研究。目的：本实验在课题组前期研究的基础上,对保护剂中甘油浓度、冻干程序(搁板温度、干燥时间)及保存时间与细胞回收率、溶血率、残余水含量的关系进行了研究；同时,对冻干红细胞回收率、残余水含量测定等技术方法进行了对比分析,为进一步探讨红细胞冻干残余水对红细胞冻干保存的影响提供理论及实验基础。方法：用不同甘油浓度保护剂处理红细胞,设置不同搁板温度及次级干燥时间,用普通光学显微镜观察细胞形态,用计数板、全自动血球计数仪计数红细胞,氰化高铁法测定血红蛋白,分析细胞复水、洗脱保护剂恢复等渗后细胞回收率、溶血率情况。用热重法、Karl-Fischer化学法及其改进方法测定冻干红细胞水含量,对比不同方法的结果,分析不同保护剂组的冻干红细胞剩余水含量变化情况。结果：1、本研究所用保护剂中不同甘油浓度(3%,6%,9%,12%,15%,18%,21%)(w/v)对红细胞冻干保存的影响：各组冻干复水后的红细胞形态正常,冻干红细胞残余含水量为(11.53±0.33)%～(35.32±1.53)%,细胞回收率为(51.04±6.14)%～(84.37±8.62)%,细胞溶血率为(15.86±2.23)%～(43.43±6.51)%。残余含水量随甘油浓度的增大而升高,具有很好的相关性,R2=0.9963；9%,12%,15%三组细胞复水回收率、溶血率差异无统计学意义(P0.076),细胞冻干保存效果较好与其余各组之间差异有显著性(P0.01)。2、不同搁板温度-60℃,-50℃,-40℃,-30℃组,洗脱保护剂后细胞回收率分别为58.50±7.29,22.67±2.10,21.52±1.70,29.73±1.35,细胞溶血率分别为77.55±3.26,82.31±1.16,85.30±1.35,84.37±0.62,残余水含量分别为25.18±0.19,22.12±1.46,23.02±1.25,26.19±0.58。当搁板温度为-60℃、次级干燥时间为2h时,红细胞冻干保存效果最优,洗脱保护剂后细胞回收率、溶血率与其余各组比较差异有显著性(P0.01)。不延长次级干燥时间组(次级干燥2h),红细胞冻干保存效果优于延长次级干燥时间组(次级干燥2h后再延长24h),差异有显著性(P0.01),两组冻干红细胞残余水含量差异无显著性,P=0.273。红细胞冻干后随着保存时间延长,细胞回收率呈下降趋势,不同保存时间段溶血率无统计学差异(P0.05)。3、冻干红细胞洗脱保护剂恢复等渗后计数,仪器计数结果为(2.29±0.08)×1012,手工计数结果为(0.71±0.11)×1012,差异有显著性(P0.01)。Karl-Fischer法、Karl-Fischer联合卡式炉法、Karl-Fischer法联合质量差法及热重法,测定冻干红细胞剩余水含量百分比分别为(3.20±0.52)%,(6.70±1.22)%,(10.07±0.19)%,(25.18±0.42)%,结果有显著性差异(P0.01)。结论：1.本实验所用红细胞冻干保存保护剂配方最适甘油浓度为(9-15)%(w/v),最适搁板温度为-60℃,次级干燥时间为2h;3.甘油浓度与残余含水量具有线性相关性,可以采用不同甘油浓度来控制残余水含量;3.热重法较Karl-Fischer法、KF联合质量差法及KF联合卡式炉法——检测残余含水量结果偏高；KF联合卡式炉法能有效避免样本溶解不完全问题,测量结果准确性高于单纯的Karl-Fischer法;4.当红细胞发生损伤时,应用计数板法测定冻干红细胞回收率,可有效避免损伤细胞对计数结果准确性造成干扰。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R457.1

【参考文献】