供者B细胞及抗体的产生在慢性GVHD中的作用

发布时间：2018-01-08 14:38

本文关键词：供者B细胞及抗体的产生在慢性GVHD中的作用　出处：《南方医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景及目的异基因造血干细胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)广泛应用于治疗血液系统肿瘤与非血液系统肿瘤、再生障碍性贫血、遗传与代谢性疾病等。移植物抗宿主(Graft-versus-host disease,GVHD)是allo-HSCT后主要的致病及致死原因,限制了其的广泛应用。传统上,根据发病的时间,GVHD分为急性GVHD(acute GVHD,aGVHD)和慢性GVHD(chronic GVHD,cGVHD),移植后前一百天之内发生的GVHD定义为急性GVHD,移植后一百天之后发生的GVHD定义为慢性GVHD。然而这种定义现在已经不精确及不适用了,在接受非清髓预处理方案或者供者淋巴细胞输注的病人一百天之后仍可发生急性GVHD,而慢性GVHD可发生在移植后一百天之内伴随着的急性GVHD的发生。急性GVHD包括经典的急性GVHD(红斑丘疹,胃肠道症状或瘀胆型肝炎)还包括移植100天后持续反复发作或者晚发的急性GVHD。慢性GVHD包括经典的慢性GVHD(硬皮病,狼疮样综合症,皮肤粘膜干燥综合症,慢性肝病以及闭塞性细支气管炎等),还包括重叠综合症,即伴随典型急性GVHD发生的慢性GVHD。过去三十年里,慢性GVHD的预防和治疗没有很大的突破,原因在于对于慢性GVHD的发病机理缺乏理解。不同于急性GVHD,慢性GVHD与自身免疫性疾病有许多相似之处,如硬皮病,狼疮样综合症,血清IgG自身抗体水平升高,系统性胶原沉积。慢性GVHD的免疫病理更加复杂。急性GVHD是同种异体反应性的供者T细胞介导的细胞毒反应。预处理方案,高剂量的放化疗导致组织损害,损害的组织释放促炎细胞因子(如IL-1b和TNF-a),趋化因子,以及细菌产物(LPS),病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)等,他们导致宿主固有免疫细胞包括抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)的激活。激活的宿主抗原提呈细胞如:树突状细胞(dendritic cells,DCs)迁移到输出淋巴结,在那里激活同种异体反应性供者T细胞。供者的CD4~+T细胞分化为T辅助细胞1(T helper 1,Th1),T辅助细胞2(Thelper 2,Th2)和T辅助细胞17(Thelper 17,Thl7);供者的CD8+T细胞分化为细胞毒性T细胞 1(cytotoxicTcell1,Tc1),细胞毒性T细胞2(cytotoxicTcell2,Tc2),和细胞毒性T细胞17(cytotoxic Tcell 17,Tc17)。由于炎症微环境的影响,同种异体反应性T细胞主要分化为T辅助细胞1和细胞毒性T细胞1。激活的T细胞迁移到GVHD靶器官(如肠道,肝脏,肺脏和皮肤)。在那里T细胞产生趋化因子,动员供者类型的固有免疫细胞介导急性GVHD的发生。慢性GVHD由自体反应性CD4~+T和B细胞介导,慢性GVHD经常伴随着急性GVHD的发生。在急性GVHD中,激活的T细胞浸润胸腺,破坏胸腺上皮细胞,导致胸腺的阴性选择破坏,产生自体反应性T细胞。GVHD破坏胸腺,导致自体反应性致病性的T细胞增加,Foxp3+天然调节性的T细胞降低。这些自体反应性T细胞在外周与供者的树突状细胞和B细胞相互作用。这种相互作用导致自体反应性T细胞向TTh1,Th2和Th17分化.这种相互作用还激活自体反应性B细胞产生自身抗体。而且在急性GVHD中,一些同种异体反应性CD4~+T细胞,它们也可与供者树突状细胞以及B细胞相互作用,在外周持续扩增。随着急性GVHD的减弱,Th1细胞相对减少,Th17和Th2细胞相对扩增。同种自体反应性CD4~+T,B细胞和他们产生的抗体共同介导慢性GVHD的发生。在慢性GVHD的发病机制中,自体反应性CD4~+T释放出纤维化细胞因子如IL-2,IL-10及转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGFβ1)。这些细胞因子进一步激活巨噬细胞,产生血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)和TGFβ1。这些分子诱导组织成纤维细胞的活化和增殖以及胶原的大量产生。Th17细胞产生IL-17,IL-6,IL-21,IL-22导致皮肤的损害。作为有效的抗原提呈细胞,供者B细胞增强移植物中自体反应性CD4~+T的扩增,增强供者的CD4~+T向Th2和Th17分化。慢性GVHD的发生还与B细胞的稳态相关,慢性GVHD的病人中天然B细胞的数目相对下降,激活的记忆类CD27~+B细胞数目相对增高。TNF家族中B细胞激活因子(B cell-activating factor,BAFF)与慢性GVHD的发展以及严重程度相关。高水平的BAFF促进同种异体反应性和自体反应性B细胞的生存,同种自体反应性B细胞促进慢性GVHD的发生。B细胞产生的抗体在慢性GVHD中的作用仍不清楚。一方面,有人报道对血小板衍生的生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)产生的刺激性自身抗体可在系统性硬皮病及慢性GVHD的病人中发现,但是没有发生慢性GVHD的病人未发现,体外anti-PDGFR抗体可以诱导人类纤维细胞胶原的产生。在性别不相合的移植中,针对H-Y次要组织相容性抗原的抗体也与慢性GVHD的发生相关。还有人报道,在小鼠模型中,供者B细胞同种异体反应性抗体的沉积,特别是IgG2c的沉积,与肺支气管阻塞,肝脏的纤维化等慢性GVHD的发生相关。鉴于这些发现,抗体可能在慢性GVHD的发病机制中起重要作用。另一方面有人报道转移GVHD老鼠自体反应性抗体到正常的老鼠体内,并不能产生自身免疫性疾病;还有人报道显示B细胞可以不依赖于抗体直接导致系统性红斑狼疮的发生。而且迄今为止,抗体参与慢性GVHD的病理学还没有被证实。在人身上除了自身抗体依赖的自身免疫现象如免疫介导的溶血或者血小板减少症,没有直接的证据显示自体反应性抗体或者同种异体反应性抗体导致慢性GVHD器官的损害。最重要的一点是,当检测到同种异体反应性或自体反应性抗体,可能仅能证明B细胞存在,无法证明是B细胞导致疾病的发生还是抗体产生的作用。综上所述,为了解决上述问题并区分抗体依赖性及抗体非依赖性B细胞的作用,我们使用了 IgH_(μγl)转基因DBA/2小鼠,这些小鼠仅有IgM~(hi)IgD-的B细胞,没有IgMloIgDhi的B细胞,血液中检测不到IgM或IgG的分泌。即这些小鼠B细胞有抗原提呈作用,但是没有抗体的分泌。我们使用与临床移植相似的主要组织相容性复合物匹配,仅次要组织相容性复合物不匹配的DBA/2到BALB/c的鼠的慢性GVHD模型,探讨B细胞以及抗体在慢性GVHD中的致病机制。这项研究将为慢性GVHD的发病提供新的观点,并为慢性GVHD治疗的新方法提供新的科学基础。方法1、小鼠:野生型DBA/2,BALB/C雄性小鼠购买于美国国家肿瘤研究所(National Cancer Institute,NCI)。将 IgH_(μγl) BALB/C 小鼠(Dr.Rajewski 惠赠)与WTDBA/2小鼠进行交配,反复交配十代。十代后,再将产生的杂合子IgH_(μγl)小鼠互相交配,使用PCR方法筛选出纯合子IgH_(μγl) DBA/2小鼠。再用流式细胞分选仪及ELISA对筛选出的纯合子IgH μγl DBA/2小鼠进行进一步验证。纯合子的小鼠仅有表达IgM~(hi)IgD-B细胞,没有IgM loIgDhi B细胞,且血清中检测不到IgM或IgG。小鼠饲养在美国希望之城国家医学中心的无菌的动物房。2、移植和GVHD的诱导:我们使用主要组织相容性复合物匹配,仅次要组织相容性复合物不匹配的DBA/2到BALB/c的鼠的cGVHD模型。BALB/c小鼠在移植前八小时,给予致死剂量的Cs137全身照射(850 cGy TBI)。八小时候后实验组给予IgH_(μγl)DBA/2 CD25~+ T细胞清除的脾细胞(CD25~+ T cell depleted spleen,CD25--SPL)(75X 10~6)或(25X 10~6),加 T 细胞清除的骨髓细胞(T cell depleted BM,TCD-BM)(5 X 10~6);或者给予 WT DBA/2 CD25--SPL(75 X 10~6)或(25 X 10~6),加(5 X 10~6)TCD-BM。对照组给予WT DBA/2 TCD-BM(5X10~6);脾脏中CD25~+T细胞的清除及骨髓中T细胞的清除先使用 Biotin 结合的 anti-CD25,Biotin 结合的 anti-CD4,Biotin 结合的 anti-CD8,随后使用anti-bition-微磁珠。然后用autoMACS细胞分选器或细胞分选柱对其进行分选,清除纯度达到99%以上。高剂量IgH_(μγl)组,低剂量IgH_(μγl)组,高剂量WT组,低剂量WT组,TCD组共五组,且每组小鼠各8只。移植后的受体监测弓背,脱毛,腹泻,体重下降,生存,蛋白尿等GVHD指标。3、组织的收集及细胞悬液的制备:小鼠用CO_2窒息法处死,收集小鼠的脾脏,外周淋巴结,胸腺,皮肤,肝脏和肺脏对其淋巴细胞进行分析。小鼠的脾脏,外周淋巴结,胸腺的淋巴细胞悬液通过70μm过滤器研磨过滤制备而成。小鼠的皮肤,先将皮肤剪成小片,放入皮肤消化液1(2-3mg/mlDispase+PBS)中37度转震荡45分钟。后转移到皮肤消化液2(RPMI +青/链霉素+ 66ug/ml Liberase TM+100ug/mgDNAsel +0.5mg/ml hyaluronidase +2%FBS)中37度转震荡90分钟。震荡结束后,加入含有EDTA的2%BSA的PBS终止消化。通过70μm过滤器过滤后,用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。小鼠的肺脏,先将含有25ul的胶原酶D和25ulDNAseI的完全培养基注入肺脏,消化30-45分钟。消化完后,用含有EDTA的2%BSA的PBS终止消化。通过70μm过滤器过滤后,用淋巴细胞分离液分离肺脏淋巴细胞。小鼠的肝脏用含有EDTA的2%BSAPBS进行研磨,制备成单细胞悬液。再用淋巴细胞分离液分离肝脏淋巴细胞。使用4激光MOFLO Cyan流式细胞仪进行流式细胞学实验,使用Flow Jo软件对实验结果进行数据分析。4、组织的收集及病理分析:小鼠用CO_2窒息法处死,收集小鼠的皮肤,肝脏,肺脏,唾液腺进行组织病理分析。小鼠的皮肤收集,先将小鼠皮肤上的毛发剃去,在小鼠背颈部切下约3cm x 5cm大小的皮肤。将皮肤面向上,肌肉面向下置于biowrap上,将皮肤在biowrap上轻轻地展开。用Surgipath Biowraps将皮肤标本包裹起来,放入病理组织盒中,并将病理组织盒放入福尔马林中浸泡。将唾液腺和肝脏取下,直接放入病理组织盒中,并将病理组织盒放入福尔马林中浸泡。小鼠肺脏的收集,将3ml的福尔马林通过气管注入肺脏,使肺脏完全充盈起来。将肺脏放入病理组织盒中,并将病理组织盒放入福尔马林中浸泡。然后将小鼠的唾液腺、皮肤、肺脏、肝脏的组织标本用石蜡包埋,制备成切片,用HE染色。制备好的HE切片用奥林巴斯显微镜观察并采集图像。5、组织的收集以及免疫荧光染色:皮肤、脾脏的冰冻组织直接包埋在最佳切割温度复合物(optimal cutting temperature compound,OCT compound)中,用干冰快速冻结,储存在-80度。胸腺的冰冻组织先放入多聚甲醛(Paraformaldehyde Solution,PFA)中4度过夜,24小时候后转移到蔗糖中4度过夜,使其完全沉淀,48小时候后转移到OCT compound固定,用干冰快速冻结,储存在-80度中。对受体皮肤及胸腺IgG免疫复合物的沉积,胸腺的胸腺上皮细胞,脾脏组织B细胞的生发中心以及IL23的分泌进行免疫荧光染色。免疫荧光染色完成后,切片用奥林巴斯荧光显微镜观察并采集图像。采集完的图像用Adobe Photoshop 7.0软件分析。6、实时定量PCR:引物如下:CCL20,正向,5,-CACTCGGTCGTCATGGGT-3',反向,5'-CATCTTCTTGACTCTTAGGCT-3';IL23,正向,5'-TATCCAGTGTGAAGATGGTTGTG-3' 反向,5'-CACTAAGGGCTCAGTCAGAGTTG-3';IL6,正向,5 '-A A G A A AT G AT G G AT G C T A C C-3',反向,5 '-GAAGGACTCTGGCTTTGTC-3';B 7 H1,正向,5'-CAGAAGCTGAGGTAATCTGGA-3,,反向,5'-TGAGTCCTGTTCTGTGGAGG-3';GAPDH,正向,5'-TCACCACCATGGAGAAGGC-3,,反向,5,-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3,。7、统计学分析:所有的数据用GraphPad软件分析(Prism Version 5.0;GraphPad Software,San Diego,C.A).小鼠死亡为生存分析的终点事件,定量数据的结果用均数±标准误(X±SEM)表示。定量数据多组间的比较用方差分析及基于方差分析的多重比较(LSD检验)。P值0.05被认为有统计学意义。结果1、我们的课题成功地建立了IgH_(μγl) DBA/2小鼠。通过IgH_(μγl) BALB/c小鼠与DBA/2杂交十代后,我们成功地获得纯合子的IgH_(μγl)DBA/2小鼠,该纯合子的小鼠仅有表达IgMhi IgD-B细胞,没有IgMloIgDhi B细胞,且血清中检测不到IgM或 IgG。2、接受IgH_(μγl)供者移植物的受者发展短暂的慢性GVHD。接受TBI放疗的BALB/C小鼠给予IgH_(μγl) DBA/2供者或WTDBA/2供者高剂量(75 x10~6)或低剂量(25x10~6)CD25~+T-清除(调节性T细胞-清除)的脾脏细胞和TCD-BM。仅给予TCD-BM的受体很健康,给予高剂量和低剂量WT DBA/2 CD25--SPL的受体发生严重的蛋白尿以及皮肤慢性GVHD。给予高剂量WT DBA/2 CD25--SPL的受体在移植后35天左右,全部死于蛋白尿和腹水。75%的低剂量WTDBA/2 CD25--SPL的受体可以生存到移植后60天,但是他们全部发生皮肤GVHD。对比之下,高剂量或低剂量IgH_(μγl) DBA/2 CD25--SPL的受体均没有出现蛋白尿,并可长期存活至移植后60天。虽然给予低剂量IgHμγ1 DBA/2 CD25--SPL的受体仅表现轻微的慢性GVHD,但是给予高剂量IgH μγl DBA/2 CD25--SPL的受体在移植后40天左右出现皮肤GVHD,并于移植后60天恢复。且病理结果显示给予高剂量IgH_(μγl) DBA/2 CD25--SPL的受体于移植后40天左右除了肺脏,出现皮肤,唾液腺及肝脏的损害,并于移植后60天恢复。这些结果显示:除了肺脏,供者B细胞抗体的产生对于慢性GVHD的发生不是必须的,但是对于慢性GVHD的维持却是必须的。3、供者B细胞产生的抗体导致淋巴细胞消减以及淋巴滤泡和生发中心的破坏。移植后40天及60天,与低剂量WT组相比,低剂量及高剂量的IgH_(μγl)组脾脏及外周淋巴结供者CD4~+T细胞的产量明显升高,且GVHD靶器官供者CD4~+T细胞的浸润明显减少(P0.05)。在移植后40天和60天,给予高剂量或低剂量IgH_(μγl) DBA/2 CD25--SPL的受体均有很好的淋巴滤泡和GC的形成。然而给予低剂量WTDBA/2 CD25--SPL的受体,淋巴滤泡和GC发生严重的破坏。流式细胞学分析结果免疫荧光结果一致,在移植后40天和60天,T滤泡辅助细胞的百分比三组间有显著区别(F=10.19,P=0.0049;F=28.48,P=0.0001)。进一步比较,T滤泡辅助细胞的百分比在低剂量WT组显著低于低剂量IgH_(μγl)组(P=0.0017;P=0.0005)和高剂量 IgH μγl 组(P=0.0155;P0.0001)。同样,在移植后40天和60天生发中心B细胞的百分比三组间也有显著区别(F=11.24,P=0.0036;F=19.18,P=0.0006)。进一步比较在低剂量WT组也显著低于低剂量 IgHμγ1 组(P=0.0030;P=0.0004)和高剂量 IgH_(μγl) 组(P=0.0024;P=0.0005)。这些结果显示:供者B细胞产生的抗体导致淋巴滤泡和生发中心的破坏,并导致淋巴组织中淋巴细胞减少。4、供者B细胞产生的抗体导致胸腺的破坏。移植后40天及60天,CD4~+CD8+双阳性胸腺细胞的比例在三组间有显著区别(F=44.07,P0.0001;F=26.84,P=0.0002)。给予高剂量和低剂量IgH_(μγl)脾细胞的受体中,CD4~+CD8+双阳性胸腺细胞的比例与给予TCD-BM的受体相似,大于80%。然而给予低剂量WT脾细胞的受体,CD4~+CD8+双阳性胸腺细胞的比例小于20%。同样移植后40天及60天,CD4~+CD8+双阳性胸腺细胞的产量在三组间也有显著区别(F=7.08,P=0.0142;F=45.00,P0.0001)。低剂量WT组CD4~+CD8+双阳性胸腺细胞的产量显著低于高剂量IgH_(μγl)组(P=0.0149;P=0.0002)和低剂量IgH_(μγl) 组(P=0.0071;P0.0001)。胸腺髓质上皮细胞免疫荧光显示,给予IgH_(μγl)供者脾脏细胞的受体胸腺髓质上皮细胞没有破坏,但是给予WT供者脾脏细胞的受体,胸腺髓质上皮细胞破坏严重。这些结果显示供者B细胞产生的抗体在慢性GVHD中导致胸腺髓质上皮细胞的破坏。5、供者B细胞产生的抗体可以导致Th17细胞在淋巴器官和GVHD靶器官的扩增。移植后40天及60天,给予IgH_(μγl)脾细胞的受体和给予WT脾细胞的受体,在脾脏细胞中Th17的比例没有区别。不同的是,移植后40天及60天,给予低剂量IgH_(μγl)脾细胞的受体外周淋巴结中Th17的比例显著低于给予低剂量WT脾细胞受体(P=0.0164;P=0.0003)。虽然移植后40天,在接受IgH_(μγl)脾细胞的受体和接受WT脾细胞的受体皮肤组织中有很少的Th17细胞。但在移植后60天,给予WT脾细胞的受体,皮肤组织中Th17细胞的比例要显著高于给予高剂量IgH_(μγl)脾细胞的受体(P=0.0002)和给予低剂量IgH_(μγl)脾细胞的受体(P=0.0001)。这些结果显示,B细胞产生的抗体导致移植早期Thl7在淋巴结的扩增以及移植后期Th17在皮肤组织的扩增相关。6、我们观察到移植后40天,与低剂量IgH~(μYl)DBA/2CD25-SPL受体相比,在外周淋巴结以及皮肤,低剂量WT DBA/2 CD25-SPL受体及高剂量IgH_(μγl) DBA/2CD25-SPL受体有较高比例的CD11c~+CD11b~-的树突状细胞(P0.01)。免疫荧光也显示出,在外周淋巴结以及皮肤,低剂量WTDBA/2CD25-SPL受体及高剂量IgH_(μγl) DBA/2 CD25-SPL受体有较高比例的CD11c~+CD11b~-的树突状细胞(P0.01)。而且,在外周淋巴结以及皮肤,与低剂量IgH_(μγl) DBA/2CD25-SPL受体相比,低剂量WTDBA/2CD25-SPL受体分泌更多的IL-23。(P0.05)。这些结果显示:供者B细胞产生的抗体在外周淋巴结及皮肤组织刺激树突状细胞分泌IL-23,从而导致Th17细胞的扩增。7、我们发现移植后40天,免疫组化显示:对比低剂量WTDBA/2CD25-SPL受体,低剂量IgH_(μγl) DBA/2 CD25-SPL受体皮肤组织B7H1的表达增强。与之一致的是:荧光定量PCR显示:皮肤组织中B7H1mRNA表达水平也升高(P0.01)。而且,我们进一步发现低剂量IgH_(μγl) DBA/2CD25-SPL受体,皮肤组织中树突状细胞也上调B7H1的表达(P0.01)。这些结果显示供者B细胞产生的抗体导致皮肤组织下调B7H1的表达,从而增强慢性GVHD的发生。结论1、供者B细胞产生的抗体导致胸腺的破坏、外周淋巴细胞消减、滤泡及生发中心的破坏。2、供者Thl细胞与早期皮肤cGVHD的发生相关,而供者Thl7细胞与晚期皮肤cGVHD的发生及持续的皮肤GVHD的发生相关。3、供者B细胞产生抗体,抗体沉积于皮肤组织,刺激DC分泌IL-23以及单个核细胞分泌IL-6。导致组织释放CCL20增加,增强Thl7细胞迁移至皮肤组织,与此同时,增加的IL-6以及降低的IFN-γ,导致B7H1表达的下调,使得慢性GVHD持续的发生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R457.7

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