基于DNA催化颈环自组装致病菌检测新方法研究
本文关键词：基于DNA催化颈环自组装致病菌检测新方法研究 出处：《重庆医科大学》2015年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：近年来,细菌感染成为一个全社会共同关注的严峻问题。尤其是抗生素广泛甚至不合理使用,导致耐药性相当严重。超级细菌的产生已引起医学界广泛关注。另外,在细菌感染的诊断、监测以及医院感染的流行病学调查、消毒灭菌效果的评价等方面,临床微生物学检验也具有特别重要的作用。因此,建立一种通用、简单、快速、价廉、灵敏、特异的对病原菌检测方法显得极其重要。本研究主要包括以下两个部分：1.基于DNA催化颈环自组装高灵敏检测肺炎链球菌的比色传感研究肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)是一种常见的致病菌,可以引起一系列感染性疾病,如社区获得性肺炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症等。本研究以肺炎链球菌lytA基因的部分序列为靶物质,结合一个DNA信号转换器和颈环自组装(catalyzed hairpin assembly, CHA)信号放大策略,构建DNAzyme比色传感器对其进行高灵敏度的检测。将靶物质DNA与一个转换器颈环DNA相结合,形成新的核酸序列并打开颈环,暴露出颈环干封住的核酸序列,以此触发CHA循环放大反应。催化颈环自组装反应后,产物含有大量自由的并且富含鸟嘌呤G的核酸链。当氯化高铁血红素存在的情况下,可与富含鸟嘌呤的核酸链结合形成G-四联体复合物,即DNAzyme。DNAzyme具有类辣根过氧化物酶活性,在H202存在的情况下,能够催化底物2,2’-连氮基-双-(3-乙基并二氢噻唑啉-6-磺酸)二价阴离子(ABTS2-)氧化成蓝绿色物质ABTS-。在最优条件下,50 pM-200nM的浓度范围内吸光度值与合成靶序列的浓度对数成线性关系,最低检测限是32 pM。该方法不仅成功地用于检测PBS缓冲液中S.pn,其最低检测线为156 CFUmL-1,还应用于检测临床样本中的S.pn,并可通过肉眼分析结果。另外,该方法在近缘种链球菌和其他主要致病菌中展示了很好的特异性。因此该传感器将能够为临床病原微生物诊断提供有力的工具。2.基于核酸适体的通用型比色传感器直接检测鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌属革兰阴性肠杆菌,是引起急性胃肠炎的主要病原菌之一。目前致病菌的检测方法主要有：传统的细菌培养鉴定、酶联免疫吸附法(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)技术。但这些方法费时、费力、成本高、需要专业人员及较高实验条件等。因此,现场、快速、灵敏、准确的检测和鉴定致病菌极为重要。本实验建立了一种基于核酸适体特异性识别靶细菌,利用CHA模板进行信号循环放大的通用型比色传感器,可对各种细菌进行高灵敏检测。当鼠伤寒沙门氏菌存在时,与特异性核酸适体结合释放出CHA模板触发序列,催化颈环自组装,暴露G-四联体与氯化高铁血红素结合,催化ABTS2-和H2O2产生颜色变化,根据颜色变化程度对靶细菌进行定量分析。将该检测技术应用于PBS缓冲液中鼠伤寒沙门氏菌的检测,最低检测线可到103 CFU mL-1,用时仅2小时。同时,该方法仅仅通过改变转换器的序列,实现对不同的靶物质核酸和细菌的间接或直接检测,展示了其通用性。所建立的简单、通用的新方法已成功用于沙门氏菌的检测,有望该检测策略为其他临床病原菌的检测提供了一个新的检测手段。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.5
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，本文编号：1416114
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