马尔尼菲青霉氟康唑耐药机制的研究

发布时间：2018-01-13 05:03

  本文关键词：马尔尼菲青霉氟康唑耐药机制的研究　出处：《广西医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 马尔尼菲青霉 氟康唑 耐药机制

【摘要】：目的氟康唑(Fluconazole, FLC)是我国临床上治疗马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei, PM)感染的常用抗真菌药物,但临床疗效欠佳,体外药敏示MIC值较高,考虑部分PM存在FLC耐药的可能。本研究拟探讨PM FLC耐药与唑类药物靶酶基因及药物流出泵基因表达和功能的关系,了解PM对FLC不敏感的分子机制。方法 实验菌株包括2株FLC临床治疗抵抗、体外药敏提示FLC MIC较高的PM临床耐药株A1、A3；以PM标准株FRR2161为母本,通过在含FLC浓度≥64μg/ml培养基上诱导获得的6株PM诱导株C2、C3、C4、B3、B4、B5；以及标准株FRR2161。在此基础上,课题组进行了以下研究：(1)参照美国临床和实验室标准化研究所(clinical and laboratory standard institute, CLSI)的M38-A2方案并作适当修改,采用微量稀释法测定实验菌株对两性霉素B (amphotericin B, AmB)、FLC、伊曲康唑(itraconazole,ITC)、伏立康唑(voriconazole, VOC)敏感性,并借鉴白念珠菌FLC药敏判断标准建立PM FLC药敏标准；(2)在25℃时FLC耐药株与标准株进行比较,观察实验菌株的表型特征、生长速率及产孢率；(3)做铜圈小培养,观察25℃时实验菌株的产孢结构；(4)提取标准株及FLC耐药株的DNA,测定实验菌株的ITS (Internal Transcribed Spacer)区序列,进行比对；(5)对实验菌株用4种随机引物P23、P103、P105、P120进行随机扩增多态性分析(Randomly amplified polymorphic DNA, RAPD);(6)对实验菌株的唑类药物靶酶基因cyp51B进行测序,并与GenBank中公布的PM基因cyp51B序列进行比对；(7)提取实验菌株的RNA,用real time PCR分别测定各菌株中唑类药物靶酶基因cyp51B及相关药物流出泵基因的相对表达量。(8)所得数据通过软件SPSS16.0采用独立样本t检验进行比较,P0.05有统计学意义。结果 (1)建立PMFLC药敏标准：选取FLC MIC值2.0～8.0μg/ml敏感,16～32μg/ml剂量依赖性敏感,大于或等于64μg/ml判断为耐药。实验菌株除标准株FRR2161外,余菌株FLC MIC值范围为128～256μg/ml,符合FLC耐药判断标准；实验菌株均对AmB、ITC以及VOC敏感；(2)25℃时PM FLC耐药株与标准株FRR2161相比,生长速率下降(P0.05)；(3)25℃铜圈小培养实验示PM FLC耐药株产分生孢子数相对标准株FRR2161降低；(4) PM FLC耐药株和标准株FRR2161与GenBank上公布的PM ITS区序列完全一致；(5) RAPD实验中,PM FLC诱导耐药株与其母本标准株FRR2161比较,用4种随机引物进行扩增,所得产物带型完全一致,但其带型与PM FLC I临床耐药株明显不同；(6)实验菌株存在药物靶酶基因cyp51B不同碱基位点的突变,而造成相应氨基酸的替换：菌株C2、C4的靶酶基因cyp51B编码区有T1583C的点突变,导致14α脱甲基酶第440位的络氨酸被组氨酸替代(Y440H)；菌株B4、B5的靶酶基因cyp51B编码区有G1587T的点突变,导致14α脱甲基酶第441位的甘氨酸被缬氨酸替代(G441V)；菌株A1的靶酶基因cyp51B编码区有T1618C的点突变,但14α脱甲基酶没有氨基酸的替换；菌株A3的靶酶基因cyp51B编码区有G1587A、T1618C的点突变,导致14a脱甲基酶第441位的甘氨酸被天冬氨酸替代(G441D)；菌株C3、B3的靶酶基因cyp51B编码区未见点突变。(7)PMFLC耐药株与标准株FRR2161比较,药物排出泵基因AtrF、Mdr1、 PMFCZ表达量增高,差异有统计学意义(P0.05)；而靶酶基因cyp51B、药物排出泵基因ABC和MFS表达量差异无统计学意义(P0.05)。结论体外诱导PMFLC耐药株成功,并且该FLC耐药特性可稳定传代；唑类药物靶酶基因cyp51B的点突变可能是PM出现FLC耐药现象的主要原因；部分药物排出泵基因表达水平的上升可能也参与到了FLC耐药机制中。
[Abstract]:In this study , we studied the relationship between the drug resistance and the expression and function of the drug efflux pump . 瑙傚療25鈩冩椂瀹為獙鑿屾牚鐨勪骇瀛㈢粨鏋勶紱(4)鎻愬彇鏍囧噯鏍�鍙奆LC鑰愯嵂鏍�鐨凞NA,娴嬪畾瀹為獙鑿屾牚鐨処TS (Internal Transcribed Spacer)鍖哄簭鍒，

本文编号：1417551