虫媒病毒和呼吸道病毒Array-ELISA检测方法的建立

发布时间：2018-02-13 16:05

本文关键词： Array-ELISA 虫媒病毒呼吸道病毒检测　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:虫媒病毒是一些通过吸血节肢动物叮咬敏感脊椎动物而引起的自然疫源性疾病及人兽共患病的一群病毒,包括14个病毒科,500多种病毒,其中130余种可引起人、畜疾病,主要表现为发热、皮疹、关节痛、出血热和脑炎等。近年来,随着人类活动范围扩大和全球气候变暖,虫媒病毒疫源地逐渐扩大,人类与媒介的接触机会增加。在全球范围内,虫媒病毒的传播和流行程度不断扩大,新发的虫媒病毒层出不穷,对人类健康造成巨大的威胁。我国幅员辽阔,自然环境复杂,虫媒病毒宿主种类多、分布广,是多种虫媒病毒的自然疫源地,虫媒病毒是我国公共卫生安全的重大威胁。呼吸道病毒指主要以呼吸道为侵入门户,首先在呼吸道粘膜上皮细胞中增殖引起呼吸道以及全身感染,造成呼吸道及其他器官损害的病毒的总称。呼吸道病毒包括正粘病毒科、副粘病毒科、披膜病毒科、小RNA病毒科、腺病毒科和疱疹病毒科的200余种病毒。呼吸道病毒通过气溶胶和飞沫形式传播,传播能力强,人感染后发病急,往往导致群体性爆发,历史上呼吸道病毒曾多次引起世界大流行,给人类社会带来了巨大的灾难。世界卫生组织将呼吸道感染列为全球范围内导致5岁以下儿童死亡的第二大诱因,临床上的急性呼吸感染中有90~95%由呼吸道病毒引起。Array-ELISA是华大吉比爱开发的一种将经典ELISA技术和现代的芯片技术相结合的新技术,具有高特异性、高灵敏度和高通量的特点。Array-ELISA方法将多种抗原或抗体通过非接触式点样点制在96孔板的每个微孔中形成阵列,其反应原理和操作步骤与ELISA相同,最后采用电化学发光和高灵敏的电荷耦合器件感应器结合,将反应信号放大,通过配套软件读取反应结果并输出。Array-ELISA方法中捕获阵列每点所需的点样体积30n L,仅为ELISA包被体积的1/3000,却具有和ELISA相当的灵敏度。虫媒病毒和呼吸道病毒这两类病毒不仅传播广泛、传染性强、致病性强,其导致的临床症状相似,往往难以鉴别诊断,病原体的快速准确检出是采取正确治疗方法和有效防制措施的基础,本研究拟分别以6种虫媒病毒和5种呼吸道病毒为检测对象,以Array-ELISA作为技术平台,建立高特异性、高灵敏度和高通量的检测方法。方法:以乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、登革病毒2型、登革病毒4型、东部马脑炎病毒和辛德比斯病毒6种虫媒病毒病毒,以及甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒5种呼吸道病毒为检测对象,通过细胞培养法培养待检病毒,采用TCID50法对待检病毒进行滴定,复苏杂交瘤细胞制备单克隆抗体并纯化,通过ELISA和IFA对单克隆抗体的特异性和灵敏度进行初步鉴定,通过夹心ELISA优化捕获抗体和检测抗体配对,对检测抗体进行生物素标记,将捕获抗体通过非接触点样点到96孔板每个微孔形成Array-ELISA阵列,优化捕获抗体和检测抗体的浓度和反应条件,使用病毒培养物对检测体系特异性和稳定性进行验证,使用梯度稀释的病毒培养液对建立的Array-ELISA检测方法进行灵敏度测定。结果:1.通过腹水制备并纯化获得了针对6种脑炎病毒的9株单克隆抗体,对单克隆抗体的特异性和灵敏度进行了鉴定并标记生物素,对捕获抗体和检测抗体配对进行了优化,最终确定了4D5、2B5、2B8、4F9、1F1和4E11这6株分别针对乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、登革病毒2型、登革病毒4型、辛德比斯病毒和东部马脑炎病毒的单克隆抗体同时作为捕获抗体和检测抗体,捕获抗体浓度分别为0.025mg/m L、0.025 mg/m L、0.05 mg/m L、0.2 mg/m L、0.05 mg/m L、0.05 mg/m L,检测抗体浓度分别为0.002 mg/m L、0.001 mg/m L、0.012 mg/m L、0.002 mg/m L、0.006 mg/m L、0.008 mg/m L时具有良好的特异性和灵敏度,以此条件建立Array-ELISA检测方法对乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、登革病毒2型、登革病毒4型、东部马脑炎病毒和辛德比斯病毒的检测灵敏度分别为3.1×103TCID50/m L、3.1×103 TCID50/m L、3.1×103 TCID50/m L、1.3×104 TCID50/m L、1.3×104 TCID50/m L和2.5×104 TCID50/m L;2.购买了针对5种呼吸道病毒的5对单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体,对这些单克隆抗体的特异性和灵敏度进行了鉴定,将检测抗体标记生物素,对捕获抗体和检测抗体浓度进行了优化,针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒3型的捕获抗体A108、B12、8C5、8C4和C65467M的浓度分别为0.025mg/m L、0.1 mg/m L、0.1 mg/m L、0.05 mg/m L和0.1 mg/m L,检测抗体A245、B27、9C5、1E11和C65329M的浓度分别为0.005 mg/m L、0.0014 mg/m L、0.02mg/m L、0.02 mg/m L和0.024 mg/m L时具有良好的特异性和灵敏度,以此条件建立的Array-ELISA检测方法对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和副流感病毒3型的灵敏度分别为3.1×102 TCID50/m L、1.3×103TCID50/m L、5×103 TCID50/m L、2.5×103 TCID50/m L和1.5×104 TCID50/m L。结论:分别建立了针对6种虫媒病毒和5种呼吸道病毒的Array-ELISA检测方法,具有良好的特异性和灵敏度。采用的Array-ELISA技术平台兼具ELISA的高特异性、高灵敏度和芯片技术的高通量,可用于病原体的多重检测。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.6

【参考文献】