金黄色葡萄球菌对利奈唑胺耐药机制及其分子基础研究

发布时间：2018-03-22 01:15

本文选题：金黄色葡萄球菌　切入点：利奈唑胺　出处：《浙江大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：金黄色葡萄球菌是人体常见致病菌之一,可引起多种严重感染,由于耐药金黄色葡萄球菌的广泛流行给临床治疗带来严峻挑战。利奈唑胺作为第一个应用于临床的VA唑烷类抗阳性菌药物,被用于各种耐药金黄色葡萄球菌感染治疗,但随着临床广泛应用,细菌对利奈唑胺的快速耐药引起临床广泛关注。本论文对来自全国县级医院门诊分离金黄色葡萄球菌对利奈唑胺的耐药机制及其分子基础进行了全面研究,以期对耐药控制和临床用药提供依据。第一部分：本研究收集了2010年至2011年全国12个省30家县级医院分离的475株金黄色葡萄球菌,用稀释法测定这些菌株对青霉素G、苯唑西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢唑林、头孢呋辛、庆大霉素、环丙沙星、磷霉素、克林霉素、红霉素、利奈唑胺、万古霉素、替考拉宁及四环素等药物的MIC值。根据对利奈唑胺MIC水平的不同,将这些菌株进行分组,分别在各组随机抽取一定数量菌株进行耐药机制研究。应用PCR测序法对其中36株菌株筛检利奈唑胺靶位23S rRNA等位基因(rrn1-rrn6)突变点和利奈唑胺靶位L蛋白(L3,L4,L22)基因突变。对475株金黄色葡萄球菌筛检cfr基因,对cfr阳性菌株检测体外药敏情况和进行MLST分子分型,并筛检利奈唑胺靶位23S rRNA等位基因(rrn1-rrn6)突变点和利奈唑胺靶位L蛋白(L3,L4,L22)基因突变。体外药敏试验结果显示,475株菌株对万古霉素和替考拉宁均敏感,98.7%的菌株对磷霉素敏感,菌株对苯唑西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢唑林、头孢呋辛、庆大霉素、环丙沙星的敏感率分别为84.7%,85.9%,87.2%,86.6%,73.2%,78.2%,而对青霉素G,克林霉素,红霉素的敏感率仅为16.4%,48.7%,32.8%。按照CLSI临床折点,没检出对利奈唑胺耐药菌株。根据细菌对利奈唑胺的敏感性,将这些菌株分为5组：MIC为0.25、0.5、1、2和4μg/ml组。分别从各组选取1株,4株,10株,10株,11株,共36株菌来作进一步研究。经PCR和序列比对分析,共有12株菌在23S rRNA等位基因domainV区分别发生T2238C,G2398A, C2263T, C2112T, C2129T, C2219T, G2127A, C2234T, G2416A共9种核苷酸突变类型。有8株菌在分别在L3,L4或L22蛋白发生8个氨基酸突变。对475株金黄色葡萄球菌筛检出14株cfr阳性菌株,这些菌株利对奈唑胺的MIC为2μg/ml或4μg/ml,对替考拉宁和万古霉素均敏感,对氯霉素、克林霉素和红霉素表现较高的耐药性。经PCR和序列比对分析,这14株cfr阳性菌株中有3株在23S rRNA等位基因domain V区发生核苷酸突变,5株在L3和L4蛋白发生氨基酸突变。对这些突变点分析发现,利奈唑胺MIC为0.5μg/ml时,菌株在23S rRNA domain V和L蛋白均无发生突变；MIC为1μg/ml的10株菌中有4株菌在23S rRNA domain V发生核苷酸突变,无L蛋白氨基酸突变；MIC为2μg/ml的16株菌中,6株携带有cfr基因,有6株茵在23S rRNA domain V发生核苷酸突变,4株菌在L蛋白发生氨基酸突变；MIC升至4μg/ml的11株菌中有8株发现携带有crr基因,3株在23SrRNA domain V发生核苷酸突变,5株菌在L蛋白氨基酸发生突变。比较不同MIC组中的突变点和cft"基因发现,随着对利奈唑胺MIC值的增高,细菌位于23S rRNA或L蛋白的突变点数量和类型均增多,这种逐渐递增的突变点数量和突变类型可能为菌株由对利奈唑胺敏感变为临床耐药提供条件。第二部分：应用Southern杂交确定cft"的基因定位,用PCR walking技术分析cfr基因的周围基因序列。同时对第一部分筛选出的9个位于细菌23S rRNA等位基因domain V区的点突变,应用RNA二级结构预测软件Mfold和RNA三级空间结构预测软件3dRNA分别构建23S rRNA domain V区的二级结构和三级结构,以Pymol软件对这些空间结构进行突变碱基与药物空间作用的改变分析。 Southern杂交证实在14株菌株中cfr基因位于质粒。对携带cfr基因的约5.6kb质粒片段进行测序,结果显示cfr基因上游是一个IS256插入序列,下游紧邻的是一个orf1基因然后是一个IS256插入序列。经序列比对分析,发现本研究的质粒片段与1株来自中国动物源科氏葡萄球菌中携带cfr基因的质粒pSS-01在序列上有99%同源性。另外,2个分离自人源的科氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌的质粒pRM01和p7LC,也与本研究中携带cfr基因的质粒片段在序列上有高度相似性。14株cfr阳性菌株中有5株为ST188型,3株为ST965型,而近年来这些型别主要见于中国不同地区分离的动物源金黄色葡萄球菌。这些结果提示这14株金黄色葡萄球菌或者其携带的cfr基因可能来源于动物。对位于23S rRNA domain V区的9个突变点,分别构建其二级结构和三级空间结构,对结果分析发现：(1)MIC为1μg/ml组中菌株没有发现cfr基因或L蛋白突变,仅有的T2238C和G2398A突变点在三级结构上距离利奈唑胺结合位点距离为94.91A和102.8A,可能是导致菌株对利奈唑胺MIC值轻微增高的原因。(2)MIC为2μg/ml组的位于23SrRNA domain V区的5个突变点中,突变点C2112T和C2129T在二级结构中的碱基配对均由非常稳定的G：C配对变为不稳定的G：U配对,这种二级结构的改变可能使得rRNA茎区结构变松散或进一步影响三级空间结构；突变点G2127A发生后,二级结构中的碱基配对由不稳定的G：U配对变为相对稳定的A：U配对,也会使得二级结构的rRNA茎区结构稳定性发生变化。并且本组的5个突变点C2112T, G2127A, C2129T, C2219T, C2263T在空间结构上距离利奈唑胺结合位点距离分别为56.06A,51.96A,54.07A,58.83A,52.02A,距离相对较近,故这5个突变点在这些菌株中对利奈唑胺MIC增高具有较大贡献价值。且这组菌株在L3或L22蛋白的氨基酸突变在空间上均位于核糖体肽酰转移酶活性中心(peptidyl transferase center, PTC)区外,对利奈唑胺MIC值影响较小。(3)MIC为4μg/ml组细菌的突变点C2234T和G2416A在三级空间结构距离利奈唑胺结合位点距离分别为92.16A和72.68A,距离较远。本组的11株菌株中有8株携带有cfr基因,而本组中的L3或L4蛋白氨基酸突变位于PTC区外,因此cfr基因可能是本组菌株对利奈唑胺MIC值升高的主因。结论： 1.临床分离菌株中,没有检出符合CLSI耐药折点的菌株,但细菌MIC值分布范围广,最高MIC值菌株和最低MIC值相差16倍,需要严密观察敏感性降低的发展趋势,避免耐药菌株的出现。 2.随着利奈唑胺MIC值的增高,细菌位于23S rRNA或L蛋白的突变点数量和类型均增多,这种逐渐递增的突变点数量和突变类型可能为菌株由对利奈唑胺敏感变为耐药提供条件。 3.23S rRNA domain V区突变是MIC为2μg/ml组中菌株对利奈唑胺MIC增高的主因；而MIC为4μg/ml组中,利奈唑胺MIC增高的主因可能是cfr基因,而非23S rRNA domain V区突变。 4.cfr基因已经在中国部分地区临床金黄色葡萄球菌菌株中存在,MLST分型分析和cfr周围基因环境分析提示这些菌株可能存在动物向人传播的可能。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.5

【共引文献】