风疹病毒和巨细胞病毒抗体时间分辨荧光免疫定量检测试剂的研制

发布时间：2018-03-29 00:11

本文选题：风疹病毒　切入点：巨细胞病毒　出处：《南方医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：1.研究背景及目的风疹病毒和巨细胞病毒都是TORCH筛查的重要组成病毒。风疹是由风疹病毒引起的一种急性呼吸道传染病,临床症状轻微,但母体感染风疹病毒可导致严重的后果,特别在怀孕的前三个月期间发生感染,风疹病毒可通过胎盘传染,并可能导致胎儿死亡或可能会导致严重畸形胎儿,通常概括为先天性风疹综合征(CRS)。CRS是致盲、耳聋、先天性心脏疾病和智力低下的重要原因。巨细胞感染通常是轻微或无症状。然而,孕妇怀孕期间巨细胞病毒感染引起宫内传播的危害性高,可能会导致严重的胎儿损伤,包括生长障碍和精神低下,黄疸和中枢神经系统异常。重症感染出生患儿临床上出现嗜睡、惊厥、呼吸窘迫综合征等,可在数日或数周内死亡,幸存者可出现智力障碍、运动障碍、耳聋等后遗症。巨细胞病毒对血液病患者、肿瘤病人、移植受者、HIV感染者等免疫功能低下者中则可引起严重感染,甚至危及生命。IgG、IgM抗体的血清学检测可初步确定母体的感染情况,IgG抗体产生后可存在数年或终生,仅IgG阳性提示既往感染,动态监测IgG由阴性转化为阳性即血清转化提示近期原发感染,恢复期血清比急性期血清的抗体滴度有4倍或4倍以上的升高,也可作出近期急性感染的诊断。测定IgG抗体的滴度,还可以了解人群风疹病毒和巨细胞病毒隐性感染水平和考核疫苗的免疫效果。IgM抗体通常在病毒感染后数天内产生,可持续数周至数月,IgM抗体阳性是病毒急性感染的重要指标。时间分辨荧光免疫法(TRFIA)利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及其螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质等,标记抗体／抗原,待抗原抗体反应发生后,用TRFIA检测仪测定反应产物中的荧光强度,根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值,判断反应体系中分析物的浓度,从而达到定量分析。其中解离增强镧系荧光免疫分析技术是目前应用最广泛的时间分辨荧光免疫分析方法,多标记技术则是时间分辨荧光免疫法(TRFIA)的最大亮点。本研究应用时间分辨荧光免疫法(TRFIA)解离增强技术的特点及多标记技术的优点,分别研制用于定量检测风疹病毒IgG抗体,巨细胞病毒IgG抗体,同时检测风疹病毒和巨细胞病毒IgM抗体的试剂,评价各项性能指标,并与进口试剂进行比较,评价其临床适用性。2.方法2.1采用TRFIA"间接法”分别定量检测人血清中的风疹病毒和巨细胞病毒特异性IgG抗体。2.1.1包被特异性抗原：用包被缓冲液分别将风疹病毒抗原和巨细胞病毒抗原稀释至3μg/mL,按100μL/孔包被至96孔微孔反应板中,经封闭、抽干、真空包装后成特异性反应板,2-8℃贮存。2.1.2铕标记羊抗人IgG多克隆抗体：按照5：1的标记比例,取lmg的羊抗人IgG多克隆抗体进行除杂等预处理,浓缩至4-5mg/mL后与0.2mg的DTTA-Eu充分混合,4℃反应过夜,经纯化处理后,加入终浓度为0.1%的BSA作为保护剂,-20℃贮存。2.1.3标准品的制备：用样本稀释液分别将混合的高值风疹病毒和巨细胞病毒IgG抗体血清稀释至10,20,50,100,250 IU/mL和5,10,20,40,100PEIU/mL,经校正合格后,2-8℃贮存。2.2采用双标记TRFIA "捕获法”同时定量检测人血清中的风疹病毒和巨细胞病毒特异性IgM抗体。2.2.1包被抗μ链单克隆抗体：用包被缓冲液将抗μ链单克隆抗体稀释至3μg/mL,按100μL/孔包被至96孔微孔反应板中,经封闭、抽干、真空包装后成特异性反应板,2-8℃贮存。2.2.2铕标记风疹病毒单克隆抗体：按照5：1(质量比)的标记比例,取lmg的风疹病毒单克隆抗体进行除杂等预处理,浓缩至4-5mg/mL后与0.2mg的DTTA-Eu充分混合,4℃反应过夜,经纯化处理后,加入终浓度为0.1%的BSA作为保护剂,-20℃贮存。2.2.3钐标记链霉亲和素：按照2：1(质量比)的标记比例,取0.4mg的链霉亲和素进行除杂等预处理,浓缩至4-5mg/mL后与0.2mg的DTTA-Sm充分混合,4℃反应过夜,经纯化处理后,加入终浓度为0.1%的BSA作为保护剂,-20℃贮存。2.2.4巨细胞病毒抗原生物素化：按照1：25(摩尔比)的标记比例,取lmg巨细胞病毒抗原进行除杂等预处理,浓缩至约2mg/mL后与281μg生物素(NHS-LC-Biotin)充分混合,室温反应1h,经纯化处理后,加入终浓度为1mg/mLBSA和0.05%叠氮钠作为保护剂,-20℃贮存2.2.5标准品的制备：用样本稀释液分别将混合的高值风疹病毒和巨细胞病毒IgM抗体血清稀释至2,5,15,40,80 AU/mL和5,20,80,200,400AU/mL,经校正合格后,2-8℃贮存。2.3试剂性能指标的评价2.3.1阴性/阳性参考品符合率：检测商用血清盘(PTR201或PTC203)和国家血清盘,计算符合率。2.3.2剂量-反应曲线：以参考标准品浓度的对数为横坐标,各浓度点信号值减去本底信号值的对数为纵坐标,由双对数数学模型Log-Log函数处理。2.3.3分析灵敏度：以零参考标准品测定值的均值加上2倍的标准差所得信号值减去本底信号值,代入标准曲线方程计算所得出的浓度,即为其灵敏度。2.3.4线性：将浓度值为高、低的血清样本按系列倍比稀释后进行检测,将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合,计算相关系数r。2.3.5回收率实验：在特异性抗体常规检查样本中,加入相同体积不同浓度的特异性抗体标准液,制备回收样本,计算回收率。2.3.6精密度实验：在不同的时间三次实验中,测定不同浓度的阳性血清样本(高、中、低),分别计算一次实验的分析内变异系数和三次实验的分析间变异系数。2.3.7交叉反应：选择可能会对目的抗体发生交叉反应的样本进行检测。2.3.8抗干扰实验：对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的阳性标本进行测定,比较样本添加干扰物前、后的浓度变化。2.3.9与进口试剂比对实验：自制试剂与进口对照试剂平行检测样本浓度后,使用统计软件SPSS 13.0进行数据分析。3.结果3.1自制风疹病毒IgG抗体检测试剂,分析灵敏度为0.12 IU/mL,检测范围达0.12～250 IU/mL,准确度高,检测回收样本的回收率均在90%～110%范围内,分析内和分析间精密度均10%。与进口试剂进行平行比对实验,特异性符合率为：97.10%(67/69),敏感性符合率为：99.42%(340/342),经配对卡方检验,P=1.000,表明两种检测方法无显著差异；结合κ系数检验,κ=0.965,P=0.000,说明两种检测方法吻合度有统计学意义且较强。3.2自制巨细胞病毒IgG抗体检测试剂,分析灵敏度为0.18 PEIU/mL,检测范围达0.18～100 PEIU/mL,准确度高,检测回收样本的回收率均在90%～110%范围内,分析内和分析间精密度均10%。与进口试剂进行平行比对实验,临床特异性符合率为：95.35%(41/43),临床敏感性符合率为：100.00%(368/368),经配对卡方检验,P=0.500,表明两种检测方法无显著差异;结合κ系数检验,κ=0.973,P=0.000,说明两种检测方法吻合度有统计学意义且较强。3.3自制双标记风疹病毒／巨细胞病毒IgM抗体检测试剂,分析灵敏度分别为0.15AU/mL、1.12AU/mL,检测范围分别为0.15～80.00AU/mL、1.12～ 400.00AU/mL,准确度高,检测回收样本的回收率均在90%～110%范围内,分析内和分析间精密度均10%。与进口试剂进行平行比对实验,临床特异性符合率分别为：99.15%(352/355)、98.27%(340/346),临床敏感性符合率分别为：96.43%(54/56)、93.85%(61/65),经配对卡方检验,P风疹=1.000、P巨细胞=0.754,表明两种检测方法均无显著差异；结合κ系数检验,κ风疹=0.949、P风疹=0.000；κ巨细胞=0.910、P巨细胞=0.000,说明两种检测方法吻合度均有统计学意义且较强。4.结论本研究利用时间分辨荧光免疫分析技术,成功开发了三个定量检测试剂,可以应用于检测人血清中的风疹病毒IgG抗体、风疹病毒IgM抗体、巨细胞病毒IgG、巨细胞病毒IgM抗体共四种不同的血清标志物。经评价,试剂的灵敏度高、准确度好、检测范围宽、精密度和特异性等各项性能指标均符合要求；与同类商业化进口试剂比较,其临床特异性和敏感性均无显著差异,达到了临床检测试剂的要求。特别是双标记风疹病毒/巨细胞病毒IgM抗体检测试剂,可以在一次实验中同时检测两种不同的血清标志物,极大地减少了临床检测的工作量,具有广泛的临床应用潜力。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.6

【参考文献】