阳离子脂质体通过抑制晚期自噬流导致细胞死亡

发布时间：2018-04-06 03:21

本文选题：基因治疗　切入点：阳离子脂质体　出处：《第二军医大学》2015年硕士论文

【摘要】：阳离子脂质体作为非病毒载体被大量应用于基因治疗,但是其毒性作用始终限制着其应用。于是探索其毒性机制变得尤为关键。我们的研究将试图阐明其毒性机制。我们的数据显示阳离子脂质体对肝癌细胞的细胞毒性是剂量依赖的,并伴随活性氧上调和线粒体损伤,这种损伤可以被活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸逆转。进一步数据揭示阳离子脂质体早期2小时激活自噬然后最终阻断自噬,这种调控是mTOR非依赖的。我们通过LC3-II和P62,GFP-LC3荧光,Cyto-ID染色和双荧光RFP-GFP-LC3多角度验证这种现象,接下来我们通过acridine orange和LysoTracker-Red染色发现autophagosome-lysosome融合受到影响。然后我们发现CLs可以导致溶酶体受损,表现为变肥大,溶酶体降解能力受损科溶酶体碱化。最后,通过药物和基因ATG7下调可以重现CLs的效应:细胞毒性效应,ROS上调和线粒体损伤。综合上述,我们的研究揭示了CLs通过阻断自噬引起细胞毒性,同时伴随线粒体损伤和ROS上调。我们的研究可以帮助以后评估纳米颗粒的生物兼容性以及涉及更好的基因递送载体有更好的意义。基因治疗是指在细胞中插入,修改或者敲除特殊基因来治疗疾病。它对于治疗多种疾病具有很大潜力。基因治疗最关键的就是高效和安全。两种主要的方法是病毒介倒的和非病毒介倒,相对于病毒治疗,非病毒方法相对安全和简单,非病毒方法组要有阳离子脂质体,多肽和高分子聚合物,且已经使用多年。其中阳离子脂质体是最北广泛使用的非病毒载体。尽管它比病毒载体毒性要小,但也不是完全没有毒性,这也限制了其体内外基因治疗的范围。到目前为止,只有1篇15年1月份的研究阐述了阳离子脂质体通过损害引发肺细胞系的Na+/K+-ATP泵导致细胞坏死。所以,阳离子导致细胞毒性的潜在机制依旧不明确。自噬是一种自我消化的过程,将胞浆内容物和颗粒包裹在双层膜结构中然后运输到溶酶体降解和再循环。自噬是一种细胞死亡的必须调控途径,它是肿瘤细胞抵抗应激(如饥饿)的一种自我保护和生存机制,所以促进肿瘤发生和药物抵抗。因为自噬是细胞的重要生存机制,所以抑制其可能产生细胞毒性。最近,大量的纳米颗粒包括阳离子脂质体被报道可以产生自噬,总体说来,大多数纳米颗粒被认为是自噬激活剂,纳米颗粒激活自噬引发细胞死亡已经被大量研究证实。但是,纳米颗粒在自噬调控中只作为激活剂最近却一直被反对,首先,自噬体积累可能预示着自噬激活或者自噬抑制,所以仅仅评估自噬体LC3的量是不够的。有个词语叫“自噬流”被用来代表自噬的动态发展过程:自噬小体形成,成熟,和溶酶体融合,降解。它可以更好的来评估自噬激活和抑制。纳米颗粒自噬-2-抑制的研究鲜有报道,所以许多案例中的激活情况也就不确定。事实上,在那些自噬流被研究的研究中,自噬流抑制在纳米金,富勒烯和其衍生物的生物效应中已经报道产生过。其次,诸如阳离子脂质体等纳米颗粒的毒性作用以及在很多研究中报道过。相反,大多数研究说明自噬是一种肿瘤细胞的保护机制而不是细胞死亡途径。还没有足够的证据证明自噬是一种细胞死亡诱导剂。有个通过化学或者基因抑制凋亡的人工模型显示了在细胞死亡中的角色,所以自噬在程序性细胞死亡中的角色是有争议的,纳米颗粒通过抑制细胞这种自我保护机制导致细胞毒性是有待研究的。基于以上的背景,我们假设阳离子脂质体的毒性可能是由于抑制自噬流导致的。阳离子脂质体对自噬流的影响目前为止只有2个研究报道:Roberts R发现阳离子脂质体引发自噬,Man N等发现阳离子脂质体激活自噬是mTOR非依赖的。我们需要注意的是自噬流是一个动态过程,也就是说自噬流可能在一段时间区间内激活阻断交替出现,预示着应该多个时间点来评估自噬,所以,我们假设阳离子脂质体可能可能是动态调控自噬的:也就是阳离子脂质体早期激活自噬流然后晚期将其阻断,阳离子脂质体产生的细胞毒性是由于其抑制了自噬这一肿瘤细胞的自我保护机制。为了阐明阳离子脂质体细胞毒性的潜在机制,我们细致研究了阳离子脂质体细胞毒性,阳离子脂质体对人肝脏表皮细胞系(因为大部分纳米颗粒主要累计在肝脏)自噬流的影响。我们的结果揭示了阳离子通过阻断自噬来引起细胞毒效应,同时伴随线粒体损伤和活性氧上调,我们的数据揭示了阳离子脂质体的细胞毒性机制,从而对今后研究安全的基因递送载体系统有更好的启示作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R450

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