清醒状态下小鼠背根神经节活体成像观测模型的建立及其在疼痛研究中的初步应用

发布时间：2018-05-12 04:29

  本文选题：疼痛 + 活体　； 参考：《中国人民解放军医学院》2015年硕士论文

【摘要】：目的：建立清醒状态下小鼠背根神经节(DRG, dorsal root ganglion)观测模型,并初步应用于疼痛研究中,观察疼痛模型中背根神经节中神经元的放电变化,为清醒状态下疼痛模型小鼠背根神经节观测提供可行方法。方法：本研究分为三部分：1.建立清醒状态下小鼠背根神经节双光子荧光显微镜成像观察模型：研究对象为体重20-25g成年YFP (Yellow Fluorescent Protein,黄色荧光蛋白)转基因荧光小鼠和GFP (Green Fluorescent Protein,绿色荧光蛋白)转基因荧光小鼠。通过自制的一套小鼠脊椎固定装置,建立背根神经节双光子荧光显微镜观察窗,并对清醒状态下背根神经节观察模型进行成像时长、炎症反应、运动学和行为学验证。该模型验证指标包括：成像时长;第1天和第7天两时间段,背根神经节固有炎症相关的小胶质细胞的密度变化;1-3天,4-6天,8-10天,14-15天四个不同阶段的平均运动速度、后足距、步幅、静止时间、整饰时间、进食时间;术后即时,1-3天,4-6天,8-10天,14-15天五个不同阶段的最大运动速度。另外,通过双光子荧光显微镜成像效果和脊髓灰质区电势差记录效果,初步检测该装置在清醒状态下脊髓侧面及脊髓背侧观察模型和脊髓灰质电势差记录模型中的制动效果。2.小鼠背根神经节AAV-CAG-GcaMP6 (Adeno-associated virus-CAG-GFP based-Calcium CaM probe,腺相关病毒-cag启动子-绿色荧光蛋白结合钙调蛋白和M13肽段探针)病毒注射及清醒状态下双光子荧光显微镜成像观察：研究对象为体重20-25g成年C57BL/6j (C57)小鼠。通过自制的一套小鼠脊椎固定装置对脊椎进行固定,暴露背根神经节,并进行背根神经节AAV-CAG-GcaMP6病毒注射。病毒注射14-18天后,通过双光子荧光显微镜成像进行制动效果验证和AAV-CAG-GcaMP6病毒注射后GcaMP6转染效果检测。3.小鼠疼痛模型的建立及活体清醒状态下小鼠背根神经节双光子荧光显微镜成像观察：研究对象为体重20-25g成年C57BL/6j (C57)小鼠。通过自制的一套小鼠脊椎固定装置对脊椎进行固定,暴露背根神经节,并进行背根神经节AAV-CAG-GcaMP6病毒注射。应用小鼠足底注射福尔马林建立疼痛模型。通过双光子荧光显微镜成像检测制动效果和GcaMP6转染效果,并初步观察疼痛模型中背根神经节中神经元的放电变化。结果：1.成功建立了清醒状态下小鼠背根神经节双光子荧光显微镜成像观察模型：小鼠制动效果良好,且能实现YFP转基因小鼠背根神经节长期活体观察。装置植入后运动功能得以保留。手术后连续15天连续成像,能持续稳定显示背根神经节中假单级神经元,神经元胞核,轴突和树突形态和数量。术后第7天,背根神经节中小胶质细明显增多。小鼠内置装置后连续1-3天,4-6天,8-10天,14-15天,足间距(后肢的横向距离),步幅长度,以及奔跑速度,在任意时间点,我们都没有发现其步态有差异;术后1-3天,4-6天时,小鼠整饰时间会明显增加,但是,随着时间延长,这种差异会逐渐消失。不同时间段小鼠进食时间并未发现差异。另外,我们发现内置装置的小鼠的最快速度会有些轻微的变化,但是并没有统计学意义。同时,应用该装置能够满足清醒状态下脊髓侧／背面成像及脊髓灰质区电势差随运动变化信号录入时的制动要求。2.实现了AAV-CAG-GcaMP6病毒注射,并且GcaMP6病毒转染效果良好。病毒注射14-18天后,我们能够清晰观察到整个背根神经节中的神经元,并发现背根神经节中神经元能够随着电刺激发生相应的放电活动。3.该清醒状态下小鼠背根神经节观察模型能够很好的与疼痛研究相结合。通过自制脊椎固定装置建立背根神经节观察窗,完成背根神经节AAV-CAG-GcaMP6病毒注射,实现了疼痛模型中背根神经节中神经元放电活动的变化。我们发现足底注射福尔马林疼痛模型小鼠背根神经节中部分神经元放电增快,我们推测该部分神经元可能是背根神经节中疼痛相关神经元。结论：成功建立了清醒状态下小鼠背根神经节观测模型,并将该模型成功的应用到疼痛研究实验中。为清醒状态下背根神经节疼痛觉甚至背根神经节其他感觉的生理病理研究提供了新型的可行方法。
[Abstract]:Objective : To establish an observation model of dorsal root ganglion ( DRG ) and dorsal root ganglion ( DRG ) in conscious state , and to provide a feasible method for observing dorsal root ganglia in pain model . The model is divided into three parts : 1 . Establishment of a mouse dorsal root ganglion double photon fluorescence microscope observation window for conscious state . The model verification index includes : 1 - 3 days , 4 - 6 days , 8 - 10 days , 14 - 15 days , 4 - 6 days , 8 - 10 days , 14 - 15 days . The results were as follows : 1 . The results were as follows : 1 . After 14 - 18 days after operation , the results showed that the mice were 20 - 25g adult C57BL / 6j ( C57 ) mice . The results were as follows : 1 . The results showed that the mice were 20 - 25g adult C57BL / 6j ( C57 ) mice . We speculated that the partial neurons might be the pain - related neurons in dorsal root ganglia . Conclusion : The model of dorsal root ganglia observation in conscious state was successfully established and the model was successfully applied to pain research .

【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R402

【共引文献】

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本文编号：1877099