基于磁性纳米粒子及发光技术的铜绿假单胞菌高灵敏检测及分型方法研究

发布时间：2018-05-18 15:22

  本文选题：铜绿假单胞菌 + MNPs　； 参考：《东南大学》2015年博士论文

【摘要】：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)是一种投机主义的革兰氏阴性菌,易在免疫力低下个体中盛行,因此在医院和社区获得性感染病例中许多是由P. aeruginosa引起的。P. aeruginosa是目前各种医院内感染中最广泛、最严重的问题之一,感染率居病原菌之首。由于P. aeruginosa在浓度很低的时候就能引起感染,因此早期检测对于治疗P. aeruginosa引起的感染至关重要。纳米技术在过去二十年取得了飞速的发展,由于其具有高表面积以及容易被外部磁场控制等特点,已经为快速自动化生物分子检测开启了一扇新的大门。本研究拟利用磁性纳米技术建立易于实现自动化的P. aeruginosa高灵敏检测及分型方法。具体研究内容如下。1、超分散性磁性纳米粒子(MNPs)的制备及表面修饰由于MNPs在众多领域的广泛应用,合成不同类型的MNPs一直是研究的热点。我们以PEG-4000为表面活性剂,通过高温溶剂热法制备了一种高分散性的MNPs。研究结果表明,在最佳条件下合成的MNPs粒径在350-450 nm之问,具有良好的分散性和非常窄的粒径分布。沉降实验显示,合成的MNPs与商品化MNPs MP10101相比沉降时间大大增长,12小时后仍保持良好的分散性。为了获得更加稳定的功能化粒子,我们在MNPs表面进行了层层修饰,SEM、TEM及FTIR等分析表征手段证明得到的功能化MNPs具有良好的分散性及均一的形貌。元素分析及能量图谱结果显示MNPs@Probe表面P元素含量为0.33%。2、建立了基于磁富集PCR及磁富集巢式PCR的P. aeruginosa高灵敏检测方法P. aeruginosa是一种临床上常见的条件致病菌,也是威胁人类健康的主要因素之一。由于核酸自动化检测发展的必然趋势,近几年来基于MNPs的基因组DNA分离和检测技术得到了快速发展。本论文以P. aeruginosa特异性基因gyrB为研究对象,优化并建立了一种磁富集PCR方法。在相同菌液浓度的条件下,磁富集PCR与传统PCR相比因具有更高的模板利用率,所以扩增效率更高。构建的检测方法可以有效地检测到100 cfu/mL的P. aeruginosa。在磁富集PCR的基础上,进一步发展了ecfX基因的磁富集巢式PCR,建立了高特异性、高灵敏度的检测方法。实验结果表明该方法有良好的特异性和灵敏度,P. aeruginosa的最低检出浓度为10cfu/mLo该方法不仅为P. aeruginosa高灵敏早期检测提供了技术基础,也缩短了从核酸抽提到样本检测的时间和简化了操作步骤,为实现快速自动化检测提供了新的思路。3、利用磁富集PCR、磁分离技术及化学发光技术构建了P. aeruginosa的超灵敏检测方法尽管磁富集巢式PCR方法可以实现P. aeruginosa高灵敏检测,但是由于其难以实现自动化及定量检测,在临床检验受到了诸多限制。为此,基于磁富集PCR、磁分离及化学发光技术,建立了一种P. aeruginosa易于实现自动化的超灵敏定量检测方法,并对该方法进行了条件优化。我们用该方法检测了3株P. aeruginosa标准菌株(ATCC27853、ATCC9027及CMCC10104)。结果显示,样本的化学发光强度与对照相比均具有显著性差异且Q值大于2.1。灵敏度研究结果显示,该方法能检测到30 fM的PCR产物及10 cfu/mL的样本。该方法对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、痢疾志贺氏菌及金黄色葡萄球菌样本检测结果均为阴性,表明具有较高的特异性。4、建立了基于磁富集多重PCR及化学发光的P. aeruginosa T3SS基因分型方法本研究利用磁富集多重PCR和化学发光技术建立了一种T3SS基因的快速分型方法。我们使用该方法对三个P. aeruginosa标准菌株ATCC27853、ATCC9027及CMCC10104进行了分型验证。结果表明,这三个菌株的T3SS基因中,exoT、exoY、exoS三个基因化学发光值都大于对照10倍以上,Q值也均大于2.1,三个标准株exoU的Q值均少于2.1。检测结果与电泳结果相符合,说明建立的方法是可靠的。利用该方法对22株临床样本进行了T3SS基因型的研究。结果表明,在22个临床样本中,100%的样本中含有exoT基因,72.7%的样本含有exoY基因,95.5%的样本含有exoS基因,4.5%的样本含有exoU基因,exoS与exoU基因不能同时存在于同一菌株中。临床样本分型的所有结果均与PCR分型结果一致。5、结合磁富集及磁分离双色荧光杂交技术建立了exoS基因SNP分型方法P. aeruginosa T3SS的exoU、exoS、exoT及exoY四个毒力基因都含有SNP位点。前面研究显示22个临床样本中95.5%含有exoS。结合磁富集PCR、磁分离及双色荧光杂交技术,建立了exoS基因G162A及G434C位点SNP分型方法,为了解P. aeruginosa T3SS基因型的变异提供了技术基础。利用这个方法对三株标准菌株分别进行了这两个位点的SNP分型研究。结果表明三个标准菌株的两个SNP位点G值均大于0.8,且Ⅰ值均大于3。根据分型标准分型,所有样本的SNP位点都是野生型的,且具有统计学意义。用该方法对21株含exoS的临床样本进行了G162A和G434C位点SNP分型。结果表明在21个临床样本的G162A位点分型中,57.1%为野生型,23.8%为突变型,9.5%为杂合型。在21个临床样本的G434C位点分型中,80.9%为野生型,14.3%为突变型,4.8%为杂合型。
[Abstract]:P . aeruginosa ( P . aeruginosa ) is a kind of opportunistic Gram - negative bacteria , which is easy to be used in low - immunity individuals . P . aeruginosa is one of the most widely used and most serious problems in hospital and community - acquired infections . Pseudomonas aeruginosa was highly sensitive . However , because of its difficult realization of automation and quantitative detection , a kind of highly sensitive quantitative detection method for P . aeruginosa was established on the basis of magnetic enrichment PCR , magnetic separation and chemiluminescence . The method was optimized . Three strains of P . aeruginosa were tested by this method ( ATCC 27853 , ATCC 9027 and CMCC10104 ) . The results showed that the results showed that exotoxin , exoS , exogenes and exogenes of three strains of P . aeruginosa could not simultaneously exist in the same strain .
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440
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本文编号：1906352