小鼠Lewis肺癌靶向性免疫基因治疗的实验研究

发布时间：2018-06-06 18:46

  本文选题：肺癌 + 免疫基因治疗　； 参考：《四川医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：研究背景与目的:肺癌已经成为对人类生命和健康威胁最大的头号癌症杀手,尽管过去的数十年间,手术、放疗和化疗等传统治疗不断取得进展,但目前肺癌的治疗效果仍不理想。免疫基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一,也是有望改善目前肺癌治疗现状的新方法而备受期待。引入外源性抗原基因,使肿瘤细胞表达外源性抗原,激活宿主的主动免疫,是免疫基因治疗的重要策略。多项研究展示了这种方法的可行性。然而,机体的免疫机制十分复杂,过度或广泛的免疫反应将导致严重的免疫相关性疾病。因此,肿瘤免疫基因治疗理想结果应该是治疗效应具有高度肿瘤靶向性,即免疫反应局限在肿瘤局部。用肿瘤特异性启动子对目的基因的表达进行转录调控是靶向性基因治疗的基本方法之一。端粒酶催化亚单位(telomerase catalytic subunit,TERT)启动子的转录活性具有肿瘤特异性高,适用范围广泛的特点,成为肿瘤靶向性基因治疗研究中应用最广泛的的基因转录调控元件。本课题旨在探索以小鼠TERT启动子作为基因转录调控元件,以结核杆菌抗原基因Ag85A和Ag85B为治疗基因的肺癌靶向性免疫基因治疗的可行性和具体途径。方法:1.小鼠基因组DNA为模板,通过PCR方法克隆小鼠端粒酶催化亚单位启动子(mTERTp)活性片段,并将mTERT启动子插入荧光素酶报告质粒pGL3-basic,构建mTERTp调控的荧光素酶报告质粒pGL3-mTERTp,然后用 Luciferase Assay 检测 mTERTp 在小鼠 Lewis 肺癌细胞、小鼠成纤维细胞NIH3T3、人肺腺癌细胞株A549、人食管癌细胞株EC-109和正常人胚肺成纤维细MRC-5中的转录活性;2.化学合成结核杆菌抗原Ag85A和Ag85B双基因序列Ag85A-MYC-P2A-Ag85B-HA,其中Myc和HA为标签序列,便于后续实验中对Ag85A和Ag85B蛋白表达进行检测;P2A为口蹄疫病毒连接序列,将Ag85A和Ag85B连接起来,构建到同一载体中,各自独立表达。将Ag85A-MYC-P2A-Ag85B-HA序列克隆到慢病毒质粒pLVX-EGFP-3FLAG-Puro中,构建成CMV启动子驱动的Ag85A-Ag85B慢病毒表达质粒pLVX-Ag85A-Ag85B-CMV;利用核酸分子克隆技术用mTERTp取代pLVX-Ag85A-Ag85B-CMV中的CMV启动子,构建mTERTp驱动的Ag85A-Ag85B双基因慢病毒质粒pLVX-Ag85A-MYC-Ag85B-mTERTp;3.用构建的两种 Ag85A-Ag85B 慢病毒质粒分别包装慢病毒,感染Lewis肺癌细胞和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用Western blot检测转基因细胞中Ag85A和Ag85B的表达情况;4.用卡介苗接种C57BL/6小鼠,3周后将Lewis肺癌细胞接种到C57BL/6小鼠皮下(2×106细胞/只),1周后将荷瘤小鼠随即分成7组,每组7只,经尾静脉注射Ag85A-Ag85B慢病毒,观察其对肿瘤生长的抑制作用。结果:1.本研究克隆的mTERT启动子长度331bp,其序列和GeneBank中mTERT基因序列完全一致,在Lewis肺癌细胞、人肺腺癌细胞A549和食管癌细胞EC-109中均有转录活性,在小鼠成纤维细胞NIH3T3和正常人胚肺成纤维细MRC-5中无转录活性;2.酶切反应和DNA测序结果显示,CMV启动子和mTERTp驱动的Ag85A-Ag85B基因慢病毒表达质粒构建成功,Western blot结果提示在感染pLVX-Ag85A-Ag85B-CMV 和 pLVX-Ag85A-Ag85B-mTERTp 的 Lewis细胞均有Ag85A和Ag85B表达;感染pLVX-Ag85A-Ag85B-CMV的小鼠NIH3T3成纤维细胞有Ag85A和Ag85B表达,感染pLVX-Ag85A-Ag85B-mTERTp 的 NIH3T3 细胞无 Ag85A 和 Ag85B 表达;3.接种卡介苗的Lewis肺癌细胞荷瘤小鼠,注射pLVX-Ag85A-Ag85B-CMV和pLVX-Ag85A-Ag85B-mTERTp慢病毒并未获得明显抑瘤效应。结论:1.小鼠TERT启动子具有肿瘤特异性转录活性;2.小鼠TERT启动子可以作为基因转录调控元件,驱动Ag85A和Ag85B双基因在肿瘤细胞中选择性表达;3.尾静脉注射本研究中构建的Ag85A和Ag85B慢病毒未能对经卡介苗免疫的Lewis肺癌荷瘤小鼠产生治疗作用,其原因尚待进一步研究。
[Abstract]:The research background and purpose : lung cancer has become one of the most important cancer killers threatening human life and health , but it is not ideal for the treatment of lung cancer . The expression of Ag85A - Ag85B - Ag85B - CMV and pLVX - Ag85A - Ag85B - mTERTp in mice infected with pLVX - Ag85A - Ag85B - CMV and pLVX - Ag85A - Ag85B - mTERTp were detected by Western blot .
【学位授予单位】：四川医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2;R450

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本文编号：1987745