SIRT1-p53通路在虎杖苷减轻失血性休克肾脏线粒体损伤和细胞凋亡中的作用

发布时间：2018-06-08 23:51

本文选题：去乙酰化 + 虎杖苷　；参考：《南方医科大学》2015年博士论文

【摘要】：急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是住院病人常见的并发症之一。一旦发生AKI,患者死亡率和病死率均明显增加,缺血是引起急性肾功能损伤常见原因。有报道称AKI之后,尽管部分患者当时成功存活下来但是肾脏功能出现了不可逆的损伤甚至慢性肾功能不全,后续生存率降低。据统计,急性肾脏衰竭后患者病死率高达40-60%。AKI的特征是肾小球滤过率急剧下降。人们逐渐清楚地认识到,慢性肾脏疾病基础之上的AKI是推动终末期肾病进程的一个重要因素。以往的研究表明,细胞凋亡、氧化剂和铁离子介导的细胞损伤,内皮细胞的变化、再生和修复,炎症反应等在AKI的发病机制中扮演中关键的作用。然而,越来越多的研究结果表明,线粒体功能障碍是AKI的主要原因。失血性休克作为一种病理状态的显著的特点之一是全身和局部组织灌注减少,液体复苏是重症失血性休克患者的重要治疗措施。多器官功能衰竭作为失血性休克复苏后的常见不良预后,肾脏是主要的受累的器官之一。然而,重症失血性休克再灌注(hemorrhagic shock/reperfusion,HS/R)后肾脏细胞是否也存在线粒体功能障碍尚不清楚。已经查明,AKI线粒体功能障碍发生机制主要和缺血缺氧、氧化应激、微循环障碍、线粒体动力学破坏和线粒体介导的细胞凋亡有关。p53作为肿瘤抑制因子它具有强大的调节细胞凋亡的作用。正常情况下,p53蛋白通过MDM2介导的泛素化和降解途径维持在较低水平。然而,当细胞暴露于包括基因毒性应激在内的应激环境时,p53蛋白可迅速蓄积并作用于下游靶点发挥生物学效应。主要表现为p53通过转录依赖性和转录非依赖性方式调控凋亡途径。p53转录依赖性的细胞凋亡和凋亡相关靶基因包括Bax、NOXA和PUMA的表达有关。p53转录非依赖性的细胞凋亡通过p53在线粒体和抗凋亡Bcl-2等之间的直接相互作用后促进Bax释放和线粒体外膜通透性增加,细胞色素C从线粒体膜间隙释放启动凋亡。p53的数量、稳定性和活性部分受到翻译后的多种修饰调节,包括磷酸化、泛素化和乙酰化等。已有大量文献报道,限制热量摄入可以延缓衰老、延年益寿,但由于应用中存在很多不足,临床危重病人难以在短时间治疗起效。而促进染色质沉默和转录抑制的sirtuin家族是一种模拟热量限制的替代选择,它在肾脏疾病的发病中起着重要的作用。该家族中已知沉默信息调节因子2相关酶1(Sirtuin 1,SIRT1)是一种烟酰胺腺嗓呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依赖的蛋白去乙酰化酶,它是哺乳动物Sir2的7种同源染色体之一,总序列最长,被研究得最为广泛。SIRT1最初被发现能够调节长寿、凋亡和DNA修复。SIRT1不仅去乙酰组蛋白H1、H3和H4,而且也对其他许多非组蛋白包括p53、FOXO、Ku70、P300、Rb、E2F1、NF-κB、p73和PGC-1α等产生去乙酰化作用。由于作用于上述重要的蛋白,SIRT1参与调控正常和异常细胞的多种生命进程,如应激反应、肿瘤代谢、衰老等。p53基因是第一个被发现的SIRT1去乙酰化非组蛋白靶点。即使是在组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetyltransferase,HDAC)抑制剂曲古抑菌素 A(trichostatin A,TSA)作用的条件下,细胞裂解液中的乙酰化p53也极不稳定。而蛋白去乙酰化酶的存在可能是p53乙酰化不稳定的原因,SIRT1可能是通过去乙酰化方式降低p53乙酰化水平,影响p53的线粒体移位和线粒体凋亡途径。后续有研究证实尽管在常用的HDAC抑制剂TSA存在的条件下,SIRT1的去乙酰化酶活性仍不能被有效抑制。进一步的研究证实p53的确是SIRT1的作用靶点,即SIRT1通过去乙酰化负性调节p53活性,该现象也被Vaziri和Langley等分别加以验证。近年来,白藜芦醇作为SIRT1的激活剂受到了广泛的报道,它广泛存在于红葡萄皮和红葡萄酒,改善线粒体功能和脂质水平、促进和维持PGC-1α表达,最终维持了足细胞的完整性。有趣的是,白藜芦醇被首先证实是SIRT1的激动剂且已经被证实能够减轻肾脏缺血再灌注损伤。此外,白藜芦醇还被证实能够通过SIRT1的去乙酰化p53途径减少顺铂诱发的小鼠近端小管上皮细胞损伤和多柔比星诱发的心肌细胞凋亡。除了白藜芦醇,其他新的SIRT1激动剂也有报道。由于辅酶因子NAD+是SIRT1关键信号分子。食物中添加NAD+前体烟酰胺单核苷酸或核苷能够增强氧化代谢。因此,sirtuin家族成员和他们的活化剂可能是有前途的治疗靶点。虎杖苷(Polydatin,PD),又名白藜芦醇,虎杖晶4号。它是从中国传统中药虎杖的根茎中提取的有效活性成分,化学结构已确定为3,4,5-三羟基二苯乙烯-3-β-D-葡萄糖苷,是单晶体药物。PD经过南方医科大学(原第一军医大学)病理生理教研室赵克森教授等经过30年的研究,已证实在多个疾病模型中有确切效果,多年来应用无明显毒副作用。通过赵克森教授和海王药业有限责任公司的合作开发,PD已取得了临床试验的正式批件(批件号2006L00301),成为国家为数不多的I类新药,目前正在开展临床失血性休克和烧伤Ⅱb试验,进展顺利。多项研究表明,PD对多种原因引起的实验动物休克有显著的疗效。我们实验组既往工作通过大鼠失血性和烧伤休克等模型证实PD能够扩张微血管,改善微循环,提高心输出,降低全身外周阻力,增强心功能及脉压,改变血液流变学特征,抑制白细胞粘附等。其次,PD能改善缺血再灌注模型多脏器的损伤。我室宋瑞、王兴民等均证实PD有保护重症休克血管平滑肌和脑神经元线粒体损伤的效应。张利萍等通过大鼠实验证实PD治疗心肌缺血/再灌注损伤的作用。总结其机制与下列原因有关:1、PD通过抑制线粒体KATP以及线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition,mPTP)开放,保护线粒体,发挥心脏保护作用;2、增加Bcl-2蛋白表达,减少Bax蛋白表达,减少缺血/再灌注诱导的大鼠心肌细胞凋亡;3、使钙离子内流减少和开放KATP增加钾离子外流,产生明显的抗心肌缺血/再灌注心律失常作用;4、抑制血小板聚集,降低白细胞对血管内皮的粘附性,改善微循环,抑制脂质过氧化。也有学者证实PD通过直接抗氧化应激等作用保护缺血再灌注后的心肌受损。在孕兔失血性休克模型中,PD可能通过诱导肺组织HSP-70表达,抑制肺组织NF-κB的激活,减少了血清炎症因子TNF-α等的释放以及肺组织ICAM-1粘附分子的生成,最终减轻了产兔失血性复休克后的肺损伤。最新文献报导PD还能预防脓毒症后肺损伤。既往报道显示,PD能够减少线粒体第三复合物(complex Ⅲ)氧自由基形成,具有直接保护线粒体的作用。基于上述文献回顾,本研究拟解决如下几个问题:1、HS/R后大鼠肾脏细胞是否存在线粒体损伤;2、HS/R后大鼠肾脏细胞线粒体损伤是否和SIRT1-p53有关;3、PD作用能否上调SIRT1的表达和(或者)活性,它是否是PD线粒体保护的分子机制。根据上述问题,我们将实验分为如下三个部分:1.建立HS/R的动物模型,检测肾脏细胞是否发生了线粒体损伤,哪一种细胞尤为明显;分离靶细胞,集中对受损的细胞线粒体功能进行评估;探讨SIRT1水平和活性,乙酰化p53水平和线粒体损伤之间的关系。2.探讨PD是否具有SIRT1的激动作用,PD对于SIRT1-p53信号通路的影响和保护细胞线粒体的机制;3.构建人肾细胞株(human kidney2,HK-2)缺氧复氧模型,进一步验证SIRT1-p53信号通路在缺氧复氧模型中的作用以及PD对于SIRT1-p53信号通路的激动作用。第一部分失血性休克再灌注后大鼠肾小管上皮线粒体损伤1、HS/R后大鼠肾小管上皮细胞存在线粒体损伤首先我们评估了重症失血性休克再灌注后是否存在线粒体损伤,通过透射电镜(transmission electron microscope,TEM)检查休克再灌注后肾脏细胞的线粒体超微结构。我们发现肾小管上皮细胞线粒体损伤尤为显著,表现为正常对照组(Control)大鼠的肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)线粒体形态正常,线粒体膜和嵴完整。休克后(vehicle组)RTECs线粒体形态不规则,肿胀明显,嵴部分破坏或难以辨认。因此,我们确定了肾小管上皮细胞的线粒体作为后续研究的对象。通过分离RTECs并采用我们既往报道的方法测定了 RTECs线粒体通透性转变孔(mPTP),线粒体跨膜电位(ΔΨm),细胞内ATP水平和溶酶体稳定性。共聚焦显微镜下Control组中可见明亮黄绿色的钙黄绿素荧光,而在HS/R组(vehicle组)荧光被部分淬灭。为进一度对通透性转变孔的开放程度进行定量,我们采用了流式细胞技术对calcein-AM荧光进行了分析。和control组比较,calcein-AM荧光强度在重症休克再灌注后(vehicle组)下降至34.1±2.1%(t=15.654,P=0.000)。采用荧光探针JC-1的单体JC-1/聚合体比率这一指标反映线粒体膜电位(ΔΨm)。结果发现重症休克后,单体JC-1/聚合体比率显著增加(t=-10.495,P=0.002)。采用荧光素荧光素酶法检测细胞内ATP水平,结果发现vehicle组ATP水平较正常对照组下降了 34±7.3%(t=10.939,P=0.000)。我们既往研究证实线粒体和溶酶体是密切相关,线粒体的受损可能加重溶酶体的损伤,反过来溶酶体的破坏可能会进一步恶化线粒体损伤。也可以认为,亚细胞器溶酶体损伤是线粒体损伤的一个间接的指标。介于溶酶体和线粒体的关系,我们也探讨了失血性休克RTECs溶酶体的影响。我们发现HS/R后,vehicle组出现了红色显著减弱,甚至典型的"苍白细胞"(t=7.155,P=0.000)。2、HS/R后大鼠肾小管上皮细胞线粒体促凋亡蛋白表达增加为了探讨HS/R后RTECs线粒体损伤的机制,我们采用免疫组化技术对线粒体凋亡相关蛋白的测定。结果发现HS/R之后肾脏组织较control促凋亡蛋白Bax表达显著增加而抑凋亡蛋白Bcl-2减少。为了进一步定量凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2,我们采用了免疫印迹技术测定这肾脏皮质的两种蛋白的相对含量并提取了其胞质和线粒体蛋白测定细胞色素C含量。和免疫组化结果的趋势一致,HS/R后vehicle组的Bax含量较control组增加了30±14%(t=-3.682,P=0.006)。与之对应的是Bcl-2的含量,HS/R后vehicle组Bcl-2较control组减少了29±9.8%(t=4.692,P=0.002)。细胞色素C的测定HS/R后胞质/线粒体比率较control组增加了 115±32.2%(t=-6.817,P=0.000)。上述结果表明线粒体损伤后,线粒体的凋亡相关蛋白发生了显著的变化。3、HS/R后大鼠肾皮质p53的乙酰化水平增加免疫印记结果发现,HS/R后vehicle组大鼠肾脏组织的p53蛋白较control组显著增加;不仅如此,HS/R后vehicle组Acetyl-p53也较control组增加(t=-3.063,P=0.039),这些结果提示p53可能参与了 HS/R线粒体凋亡调节。4、HS/R后大鼠肾脏皮质的SIRT1蛋白和活性减少同正常对照组(control组)相比,休克大鼠肾脏皮质中SIRT1的蛋白表达和活性分别下降了48.6±5.3%(t=8.859,P=0.002)和58.2±8.9%(t=8.329,P=0.001)。第二部分虎杖苷通过激活SIRT1减少失血性休克再灌注诱导的大鼠肾小管上皮细胞线粒体损伤1、PD和Ex527对于正常大鼠肾脏组织的SIRT1活性的影响正常大鼠7天给药后,各组大鼠肾脏组织SIRT1蛋白表达和活性的差异均有统计学意义(SIRT1 蛋白:F=30.233,P=0.000;SIRT1 活性:F=56.636,P=0.000)。其中PD组肾脏组织SIRT1蛋白表达和活性分别较溶剂对照组(control组)增加了 25.3±11.8%和30.5±13.6%;Ex527组则出现了相反的现象,该组SIRT1蛋白表达和活性分别较control降低了 30.5± 13.6%和24.3±5.4%。2、PD对于HS/R后肾脏上皮细胞SIRT1的激动作用休克给药后各组SIRT1蛋白表达和活性测定差异均具有统计学意义(SIRT1蛋白:F=22.236,P=0.002;SIRT1 活性:F=11.006,P=0.002)。PD 给药后 SIRT1蛋白表达和活性分别较vehicle组增加了 60.5±10.5%和65.1±27.9%;当Ex527添加到PD/Ex527组混合给药后,该组的SIRT1活性和蛋白表达较PD组分别下降了 33.8±14.1%和 30.1±8.8%。3、PD对于HS/R后肾脏上皮细胞p53的去乙酰化作用免疫印记测定发现尽管休克再灌注后各组p53蛋白差别无统计学差异(F=0.836,P=0.478,图7D,表12)。然而,各组Acetyl-p53差异有统计学意义(F=20.778,P=0.002)。PD给药后较 vehicle 组的 Acetyl-p53 下降了 40.8±7.9%。然而,在Ex527给药后,下降的Acetyl-p53再度升高甚至超过vehicle组的水平。这些结果说明PD可以有效地减少p53蛋白的乙酰化水平,且PD对于p53具有去乙酰化的作用。4、PD抑制线粒体凋亡信号与vehicle组比较,PD给药能够一定程度上减少Bax表达量而增加Bcl-2的表达。为了进一步定量PD对于凋亡相关蛋白的影响,我们采用了免疫印迹技术测定肾脏皮质的两种蛋白的相对含量并提取了其胞质和线粒体蛋白用于细胞色素C的测定。结果发现上述指标各组间差异均有统计学意义(Bax:F=7.423,P=0.008;Bcl-2:F=6.270,P=0.014;细胞色素C:F=14.109,P=0.001)。和免疫组化结果的趋势一致,HS/R后PD处理后Bax表达量较vehicle组显著下降。与之对应的是Bcl-2的含量,PD治疗后Bcl-2恢复接近control组。PD治疗后胞质/线粒体比率较vehicle组显著下降。而Ex527阻滞了 PD对于线粒体对于线粒体凋亡蛋白的作用,表现为Ex527也促进了细胞的线粒体凋亡蛋白Bax和细胞质中细胞色素C表达,抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达等。这些结果均提示PD可能是通过激动SIRT1信号途径发挥线粒体保护作用的。5、PD减少HS/R后的肾小管上皮细胞的线粒体损伤通过TEM观察,我们发现PD组较vehicle组肾小管上皮细胞线粒体肿胀减轻,嵴形态可见;此外所测定的各组钙黄绿素荧光、JC-1单体/聚合体、ATP水平和AO-red差异均有统计学差异(钙黄绿素荧光:F=115.480,P=0.000;JC-1:F=11.078,P=0.002;ATP:F=5.406,P=0.013;AO-red:F=11.158,P=0.002)。流式细胞测定结果提示,与vehicle组相比,PD抑制了 RTECs通透性转变孔的开放,表现为PD处理后有钙黄绿素荧光强度恢复至control组的81.1±5.6%,为vehicle组的238.2±16.3%;PD治疗后JC-1单体/聚合体比率较vehicle组有部分恢复,说明PD能够有效稳定HS/R后RTECs细胞的跨膜电位。此外,PD给药较vehicle组ATP水平显著增加。发现HS/R后,而PD治疗较vehicle组溶酶体荧光探针AO-red的强度增加,说明PD治疗能够有效恢复RTECs溶酶体的稳定性。然而,当SIRT1的抑制Ex527加入时,PD对于线粒体的保护作用都不同程序的减少了,表现为线粒体肿胀显著,嵴消失;钙黄绿素荧光减弱,JC-1单体聚合体比率增加,ATP水平下降和A0荧光强度降低。第三部分PD对缺氧复氧HK-2细胞的线粒体的保护作用1、PD和Ex527对SIRT1蛋白和活性的影响为了进一步明确PD对于SIRT1的作用,我们引入了 HK-2细胞。首先探讨了PD、Ex527和PFT-α(一种p53的特异性抑制剂)对于正常HK-2细胞的SIRT1的影响。结果发现,连续给药7天后,各组HK-2的SIRT1蛋白和活性的差异均具有统计学意义(SIRT1 蛋白:F=26.202,P=0.000;SIRT1 活性:F=36.651,P=0.000)。PD组SIRT1蛋白和活性分别较正常对照组增加了 34.4±9.8%和60.0±15.0%;而Ex527组则出现了相反的趋势,该组SIRT1含量和活性均较PD组下降了 52.9±8.6%和39.7±6.6%,组间差别均有统计学意义。但PFT-α处理组SIRT1蛋白和活性均和control组无显著差异(P=NS)。2、PD激活SIRT1-p53信号通路为了从细胞实验证实PD的具体作用机制,我们复制了缺氧复氧(hypoxia/reoxygen,H/R)细胞模型,该模型具有和HS/R类似的病理生理机制。首先,我们通过测定PD作用时间和剂量效应曲线确定了 48小时的缺氧时间和50 μM的PD给药浓度。为了进一步证实PD的作用和SIRTl-p53信号通路途径的关系,我们建立PD/Ex527 组和 PD/Ex527/PFT-α 组(pifithrin-α,PFT-α,一种 p53 的可逆抑制剂)。首先我们采用免疫印迹、细胞免疫荧光方法分别测定了各组细胞中SIRT1蛋白和活性表达,结果发现差异具有统计学意义(SIRT1蛋白免疫印迹:F=23.553,P=0.002;SIRT1 活性:F=34.362,P=0.000)。和我们预料的一致,H/R 后 vehicle组SIRT1蛋白表达、SIRT1免疫荧光强度和活性均较control组显著下降,然而PD给药后上述值分别增加至vehicle组的2.1±0.5倍、1.7±0.3倍和2.2±0.6倍。有意思的是,PD/Ex527组中SIRT1的蛋白表达和活性较PD组再度下降。该结果提示Ex527能够有效阻滞PD对于SIRT1的激动作用。而在PD/Ex527/PFT-α组,尽管有PFT-α加入,较PD/Ex527组SIRT1的蛋白表达和活性仍未有显著增加。在确定了 PD对于SIRT1激动的基础上,我们就SIRT1的下游信号p53进行了分析。结果发现,H/R后各组p53蛋白含量、线粒体移位和乙酰化水平差异均有统计学意义(p53蛋白:F=53.134,P=0.000;p53线粒体移位:F=108.571,P=0.000;Acetyl-p53 免疫印迹:F=55.264,P=0.000;Acetyl-p53 流式:F=36.450,P=0.000)。其中vehicle组测定的上述指标均较control组显著增加。与vehicle组相比,尽管PD组p53的蛋白总表达量未见显著变化,但p53线粒体移位减少并且乙酰化p53水平降低。当Ex527加入后,PD/Ex527组线粒体的p53线粒体移位和乙酰化水平均较PD组显著增加,且接近vehicle组水平。值得注意的是,在PD/Ex527/PFT-α组,增加的p53线粒体移位较PD/Ex527组再度降低但是乙酰化水平无显著变化。上述结果提示PD的作用和SIRT1激活有关,一旦SIRT1被阻滞之后,Acetyl-p53水平增加。尽管PFT-α可以抑制PD/Ex527/PFT-α组p53的表达,但Acetyl-p53水平未显著降低。3、PD减轻H/R诱发的HK-2细胞的凋亡H/R之后,各组凋亡细胞百分比差异有统计学意义(F=149.025,P=0.000)。其中vehicle组凋亡细胞百分比显著增加;PD给药则有效地抑制了凋亡(9.8±0.4%vs3.5±0.4%);与PD组相比,Ex527/PD组凋亡细胞的比率再度增加;当PFT-α加入后,PD/Ex527/PFT-α组较Ex527/PD组凋亡细胞显著减少且和PD组相当。接下来,我们就凋亡相关蛋白的表达量进行测定,我们发现H/R后Bax、Bcl-2和细胞色素C胞浆/线粒体比均有统计学差异(Bax:F=67.627,P=0.000;Bcl-2:F=40.551,P=0.000;细胞色素 C:F=134.290,P=0.000)。其中 vehicle 组较 control组促凋亡蛋白Bax、细胞色素C胞浆/线粒体比率显著增加而抑凋亡蛋白Bcl-2显著减少;与vehicle组相比,PD给药后促凋亡蛋白Bax表达显著减少,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加,细胞色素C胞浆/线粒体比下降(P=0.000);当Ex527加入后,Ex527/PD组Bax表达和细胞色素C胞浆/线粒体比较PD组再度增加,而Bcl-2蛋白显著下降;PD/Ex527/PFT-α组较Ex527/PD组促凋亡蛋白增加而抑凋亡蛋白减少。4、PD减轻缺氧复氧诱发的人近端小管上皮细胞线粒体损伤H/R之后各组Cailcein-AM、JC-1比率、ATP水平和AO-red的差异均有统计学意义(Calcein-AM:F=87.36,P=0.000;JC-1:F=268.800,P=0.000;ATP:F=76.620,P=0.000;AO-red:F=152.809,P=0.000)。vehicle 组的 Cailcein-AM 荧光较control下降了 59.7±2.4%,PD给药后该荧光强度恢复至control组的66.1±4.2%;H/R后vehicle组的JC-1单体/聚合体比例增加至control组的23.5±1.8倍而ATP水平降至control组的34±5.9%,PD给药后JC-1单体/聚合体比例比值降至2.5±0.5倍而ATP增加至control组的80±6.5%;溶酶体稳定性测定方面,H/R之后vehicle组的AO-red荧光强度降至control组的21.1±2.5%,但PD处理后该项值提高到56.3±4.8%。这些结果均提示PD能够改善H/R之后线粒体的损伤。然而,当Ex527加入到PD/Ex527组之后,上述PD对于线粒体的保护作用均被不同程度减弱且组间差别均有统计学意义,这些结果说明PD很可能是通过激活SIRT1而发挥作用的。而PD/Ex527/PFT-α组较PD/Ex527组线粒体功能功能显著恢复。提示尽管PD对SIRT1的作用被阻滞了,但是PFT-α通过抑制p53减少线粒体介导的凋亡。结论1、重症休克再灌注后肾小管上皮细胞存在线粒体损伤,SIRT1蛋白表达和活性下降以及p53乙酰化水平增加可能是肾小管上皮细胞线粒体损伤的机制。即重症休克再灌注后SIRT1的蛋白水平并活性降低,其去乙酰化活性下降,p53乙酰化水平和线粒体移位增加,促进了线粒体凋亡促凋亡蛋白增加和抗凋亡蛋白减少,线粒体外膜通透性增加,细胞色素C释放到胞质,启动细胞凋亡;2、PD具有SIRT1的激动作用,它可能是减轻重症休克再灌注后肾小管上皮细胞细胞线粒体损伤的机制之一:PD通过上调SIRT1,减少了乙酰化p53水平,抑制p53转录非依赖性线粒体凋亡途径;3、PD通过上调SIRT1-p53信号通路减少了H/R诱发的HK-2细胞凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R459.7;R692.5

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