抗HLA抗体对异基因造干细胞移植预后的影响及其机制研究

发布时间：2018-06-27 07:04

本文选题：抗HLA抗体 + 抗供者特异性抗体　；参考：《苏州大学》2015年硕士论文

【摘要】：第一部分动态检测抗HLA抗体及分析DP位点错配对HLA-12/12全相合非血缘异基因造血干细胞移植预后的影响目的:分析抗人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)抗体和HLA-DP位点错配对恶性血液病患者HLA-A,B,C,DRB1,DQB1,DQA1(HLA-12/12)全相合非血缘供体异基因造血干细胞移植(matched unrelated donor hematopoietic stem cell transplantation,MUD-HSCT)预后的影响,推动移植前抗体筛查--供体选择--预后评估--干预治疗--移植后随访临床体系的建立,并改善恶性血液病患者的预后。方法:选择2011年10月至2014年3月期间行HLA-12/12 MUD-HSCT的123例恶性血液病患者为研究对象,通过基因测序(SBT)和寡核苷酸探针杂交(SSOP)以及特异性引物聚合酶链反应(High.Res SSP)的方法,对供受者的外周血标本进行HLA-A,B,C,DRB1,DQA1,DQB1,DPA1,DPB1高分辨基因分型检测;采用流式液相芯片技术(Luminex)对123例移植前、117例移植后1个月和106例移植后3个月血清样本进行抗HLA抗体的初筛和特异性抗体检测。以平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)值判断抗体的结果:MFI㩳500为阴性,500-1000为可疑阳性,1000-2000为阳性,2000-5000为中等阳性,㧐5000为强阳性。同时结合临床预后指标,分析抗HLA抗体及DP位点错配对移植预后的影响。结果:123例患者的2年总生存率(OS)为73.2%,2年无病生存率(DFS)为69.1%。AML/MDS、ALL和CML患者的2年OS分别为56.4%、65.7%和88.9%(P=0.275),2年DFS分别为53.1%、58.2%和88.9%(P=0.217),差异均无统计学意义。患者在移植前、移植后1个月和3个月抗HLA抗体的检出率分别为37.4%(46/123)、40.2%(47/117)、22.6%(24/106),其中移植前预存抗供者特异性HLA抗体(donor-special anti-HLA antibodies,DSA)比例为4.9%(6/123)。移植后1和3个月的抗体阳性率变化在预存抗HLA抗体阴性组(30.7%vs.15.1%)和阳性组(57.1%vs.35.0%)均有统计学差异,P值为0.03和0.044。交叉比较预存抗HLA抗体阴性组和阳性组移植后1个月(30.7%vs.57.1%)和3个月(15.1%vs.35.0%)抗体阳性率,均有统计学意义,P值为0.005和0.018。移植前预存抗HLA抗体阳性组患者与阴性组患者在巨核系造血重建(14d vs.13d)、II-IV度a GVHD发生率(43.3%vs.20.4%)、OS(50.2%vs.65.7%)等方面差异均有统计学意义,P值分别为0.033、0.006、0.029,而复发(29.8%vs.17.5%,P=0.125)和治疗相关性死亡率(TRM)(33.1%vs.15.8%,P=0.224)在两组间无统计学差异。在69例AML/MDS患者中,预存抗HLA抗体阳性组对与生存率的影响更显著,与阴性组相比2年OS为35.3%和74.3%(P=0.006),DFS为36.3%和68.3%(P=0.025)。动态随访移植后1个月时,抗HLA抗体持续阴性组、阴性转阳性组、持续阳性组和阳性转阴性组的II-IV度a GVHD发生率为21.2%、17.4%、33.3%和55.6%(P=0.02),OS为84.6%、73.9%、62.5%、61.1%(P=0.082),DFS为78.8%、69.6%、58.3%、61.1%(P=0.24)。移植后3个月时,抗HLA抗体持续阴性组、阴性转阳性组、持续阳性组和阳性转阴性组的II-IV度a GVHD发生率为23.4%、11.1%、35.7%和55.6%(P=0.05),OS为83.0%、88.9%、64.3%和61.1%(P=0.15),DFS为78.8%、77.8%、57.1%和61.1%(P=0.29),TRM为10.6%、11.1%、14.3%和5.6%(P=0.81)。预存抗HLA抗体阳性组患者c GVHD的发生率高于预存抗体阴性组(52.4%vs.32.4%,P=0.036)。比较两组患者广泛性c GVHD的发生率,同样有统计学差异(9.9%vs.3.8%,P=0.045)。动态随访移植后抗体的变化,c GVHD的发生率在持续阴性组为32.6%,高于持续阳性组61.5%,差异无统计学意义(P=0.061)。供患者HLA-DP位点错配比例为83.6%(92/110),其中HLA-DPB1和DPA1位点均不合占62.7%(69/92),HLA-DPB1位点不合占16.4%(18/92),HLA-DPA1位点不合占4.5%(5/92)。HLA-DP位点相合组和错配组患者移植后II-IV度a GVHD发生率分别为24.6%和32.3%(P=0.610),OS分别为43.2%和34.2%(P=0.778),差异均无统计学意义。在预存抗HLA抗体阴性患者中,HLA-DP位点错配组患者的OS和复发率为59.5%和12.8%,低于相合组80.8%(P=0.575)和18.2%(P=0.639),差异有改变趋势。多因素分析提示移植前预存抗HLA抗体阳性与a GVHD(HR=2.876,95%CI 1.106-7.475)、c GVHD(HR=4.062,95%CI 1.580-10.440)、OS(HR=2.199,95%CI1.037-4.661)均有显著相关性,P值分别为0.03、0.004、0.04。患者疾病危险分层属于高危组是OS(HR=2.391,95%CI 1.112-5.139)和DFS(HR=2.397,95%CI 1.172-4.903)的危险因素,P值为0.026和0.017。而CD34+细胞输注数量达4*106/kg以上(HR=4.908,95%CI 1.743-13.824)和ABO血型不合(HR=3.120,95%CI 1.153-8.444)也是发生a GVHD的另一危险因素,P值为0.003和0.026。结论:动态检测移植前后抗HLA抗体变化是判断HLA-12/12 MUD-HSCT预后的重要参考指标,且抗HLA抗体阳性独立于HLA-DP位点错配影响移植患者的预后。因此,对移植前预存抗HLA抗体患者采取相应干预治疗措施有望减少移植后并发症,并改善患者的生存状况。第二部分体外研究抗供者特异性HLA抗体引起内皮细胞损伤的机制目的:建立抗供者特异性HLA抗体(DSA)的体外实验模型,探讨DSA是否影响PI3K/AKT信号传导通路中的增殖和抗凋亡通路,阐明内皮细胞的增殖是引起内皮细胞功能受损的重要因素,为DSA影响allo-HSCT预后提供理论和实验依据。方法:在DSA与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)共培养的模型中,选择HLA高分辨基因分型为A*02:01,03:01 B*15:15,35:03 C*01:02,04:01的HUVEC-I和为A*24:02,68:03 B*51:01,51:01 C*14:02,15:02的HUVEC-II为研究对象,相对应的DSA分别为抗HLA-A2、B35、Cw1、A9(A23/A24)、Bw4(B51/B53)抗体。同时,应用Luminex方法检测倍比稀释后不同浓度DSA的MFI值定为阳性组、中等阳性组、强阳性组和强强阳性组,以Ig G为对照组。在内皮细胞饥饿培养6小时后与上述不同MFI水平DSA共培养15min,冰上裂解细胞30min,抽提蛋白并测定蛋白浓度。采用Western Blot方法检测PI3K/AKT信号通路中蛋白FAK-Tyr576/577、PDK1-Ser241、AKT-Thr308、AKT-Ser473、p70S6K-Thr421/Ser424、S6RP-Ser235/236磷酸化和总蛋白的表达水平,及蛋白Bcl-2和β-actin的表达。同时选择终浓度为0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml的DSA与内皮细胞共培养15min进行上述相同的实验。结果:1.DSA浓度和MFI值的相关性抗HLA-A2、A24、B51抗体浓度分别为0.01μg/ml、0.011μg/ml、0.094μg/ml时,其MFI值在2000左右为阳性水平;为0.031μg/ml、0.023μg/ml、0.25μg/ml时,其MFI值在7000左右为中等阳性;为0.077μg/ml、0.05μg/ml、0.75μg/ml时,其MFI值10000左右为强阳性水平;为0.153μg/ml、0.5μg/ml、1.5μg/ml时,其MFI值在14000-20000为强强阳性水平。在一定浓度范围内,随着抗体浓度的增加,MFI值升高;超过一定浓度后,MFI值不再继续上升呈现饱和趋势,即抗体表达量达到平台期。故体外抗HLA抗体和HLA抗原结合的曲线呈现逐渐上升型变化。2.DSA激活内皮细胞PI3K/AKT增殖和抗凋亡信号通路2.1抗HLA-A位点抗体刺激内皮细胞增殖和抗凋亡蛋白磷酸化表达不同MFI值的抗HLA-A2抗体与HUVEC-1共培养15min,特异性抗原抗体结合后,使PI3K/AKT信号通路上游蛋白PDK1在Ser 241位点磷酸化活化。继信号通路上游蛋白磷酸化活化后,增殖通路蛋白AKT-Thr308、p70S6K-Thr421/Ser424、S6RP-Ser235/236也磷酸化活化,它们的磷酸化表达量在对照组、阳性组、中等阳性组、强阳性组、强强阳性组分别为54%、73%、100%、62%、37%;55%、72%、94%、100%、50%;51%、65%、68%、100%、82%(P㩳0.001),当抗体MFI值为中等阳性和强阳性时,它们的磷酸化表达量最大。同时,抗凋亡通路中间蛋白AKT-Ser473和终末蛋白Bcl-2表达,其表达量在对照组、阳性组、中等阳性组、强阳性组、强强阳性组分别为41%、31%、32%、100%、56%和39%、58%、100%、97%、60%(P㩳0.001),当抗体MFI值为中等阳性和强阳性时,其磷酸化表达量最高。当不同浓度的抗HLA-A2抗体与HUVEC-1共培养15min后,同样可诱导上游蛋白FAK-Tyr 576/577和PDK1-Ser 241磷酸化活化。继而,增殖通路中间蛋白AKT-Thr 308磷酸化活化,其表达量在对照组、0.01μg/ml组、0.1μg/ml组、1.0μg/ml组、10μg/ml组分别为87%、94%、97%、94%、100%,活化后的AKT蛋白进一步激活其下游因子p70S6K-Thr 421/Ser 424和增殖通路终末蛋白S6RP-Ser 235/236,二者的表达量在不同组分别为62%、88%、92%、88%、100%和34%、42%、60%、64%、100%(P㩳0.001),表达量随着浓度的增加而增强。同时,抗凋亡通路也被激活,AKT-Ser473的表达量在不同组分别为54%、8%、25%、84%、100%;抗凋亡通路终末蛋白Bcl-2的表达量在不同组分别为80%、79%、84%、100%、91%(P㩳0.001)。因此,不论是不同MFI值或是不同浓度的抗HLA-A2抗体均可激活PI3K/AKT信号通路,诱导增殖和抗凋亡蛋白表达,并呈现一定强度和浓度差异性,诱导内皮细胞发生增殖和抗凋亡。当终浓度分别为0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的抗HLA-A24抗体与HUVEC-2共培养15min后,PI3K/AKT信号通路终末蛋白S6RP-Ser 235/236的磷酸化表达量在对照组及不同浓度组分别为76%、95%、100%、90%、93%、88%、90%、94%、93%,其磷酸化表达量水平均较高,但是无明显改变趋势。这可能是由于HLA-A24和23抗体是A9的分解产物,抗A23和A24抗体可识别相同的抗原表位所致。2.2抗HLA-B位点抗体使增殖通路终末蛋白S6RP在Ser 235/236位点磷酸化不同浓度抗HLA-B35抗体与HUVEC-1共培养15min,PI3K/AKT增殖通路终末蛋白S6RP磷酸化活化,其磷酸化表达量在对照组、0.01μg/ml组、0.1μg/ml组、1.0μg/ml组、10μg/ml组分别为70%、36%、100%、85%、96%,当抗体浓度达到0.1μg/ml以上时,磷酸化表达有所增强,但趋势不明显。抗HLA-B51抗体与HUVEC-2共培养15min,在对照组、0.01μg/ml组、0.1μg/ml组、1.0μg/ml组、10μg/ml组S6RP磷酸化表达量分别为91%、98%、100%、90%、99%。增加DSA抗体浓度,其磷酸化表达量在对照组、1μg/ml组、5μg/ml组、10μg/ml组、15μg/ml组、30μg/ml组、45μg/ml组分别为89%、88%、98%、92%、96%、100%、97%,其表达均无差异性。因此,不论是低浓度还是高浓度的抗HLA-B35抗体和B51抗体与内皮细胞共培养之后,蛋白S6RP磷酸化趋势表达均不明显,考虑这可能是因为HLA-I类分子中存在抗原强弱表达的不同,HLA-B位点抗原性弱于A和C位点。2.3抗HLA-Cw1抗体诱导增殖通路终末蛋白S6RP-Ser 235/236磷酸化抗HLA-Cw1抗体与HUVEC-1共培养15min,抗原抗体结合诱导PI3K/AKT增殖通路终末蛋白S6RP-Ser 235/236磷酸化,其表达量在对照组、0.01μg/ml组、0.1μg/ml组、1.0μg/ml组、10μg/ml组分别为37%、44%、88%、97%、100%(P㩳0.001),磷酸化表达量随着抗体浓度的增加而增强。故不同浓度抗HLA-Cw1抗体也可激活PI3K/AKT增殖通路,刺激增殖终末蛋白表达并呈现浓度依赖性,并诱导内皮细胞增殖。结论:成功建立了DSA的体外实验模型,并且证实DSA可以激活内皮细胞PI3K/AKT信号传导通路,引起细胞增殖和抗凋亡;同时发现HLA-I类位点中可能存在抗原性强弱不同,A和C位点的抗原性较B位点强。因此,此实验结果为继续研究抗HLA抗体和内皮细胞的功能奠定了基础,也为今后临床研究DSA影响HSCT预后提供了实验依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R457.7

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