实时荧光定量PCR检测HSV-2方法的建立

发布时间：2018-06-30 09:16

  本文选题：Ⅱ型单纯疱疹病毒 + 实时荧光定量PCR　； 参考：《中国病原生物学杂志》2016年05期

【摘要】：目的建立一种快捷、灵敏、特异的Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 2,HSV-2)实时荧光定量PCR检测体系。方法设计HSV-2糖蛋白E基因特异性引物,PCR扩增gE基因片段,并与pGEM-T-easy载体连接,构建pGEM-T-easy-gE2重组质粒。以连续10倍稀释的浓度梯度制备PCR体系标准品质粒,应用SYBR Green法建立gE2real-time PCR方法并优化引物浓度、Mg2+浓度、退火温度和循环程序等条件,绘制标准曲线,并验证方法的敏感性、特异性和稳定性;用该方法检测HSV-2感染小鼠生殖道拭子标本。结果 gE2real-time PCR的标准品线性关系良好(r2=0.997),其他妇科常见病原体无特异扩增;方法的最低检测质粒浓度为3.85×101 copy/μl,试验的变异系数1%,检测30份小鼠HSV-2感染生殖道拭子标本的阳性率为96.7%,高于常规PCR方法(80.0%)。结论gE2real-time PCR法检测HSV-2具有灵敏、特异、重复性好,可用于HSV-2定性分析和病毒载量检测。
[Abstract]:Objective to establish a rapid, sensitive and specific real-time quantitative PCR system for the detection of herpes simplex virus 2 HSV-2. Methods the ge gene fragment was amplified by PCR with HSV-2 glycoprotein E gene specific primer and ligated with pGEM-T-easy vector to construct pGEM-T-easy-gE2 recombinant plasmid. The standard quality particles of PCR system were prepared by continuous 10-fold dilution concentration gradient. The method of SYBR Green was used to establish gE2real-time PCR method. The conditions of primer concentration, annealing temperature and cycle procedure were optimized, the standard curve was drawn, and the sensitivity of the method was verified. The specificity and stability of this method were used to detect the reproductive tract swabs of mice infected with HSV-2. Results there was a good linear relationship between gE2real-time PCR standard and other common gynecological pathogens (R2D0.997), but no specific amplification was found in other gynecological pathogens. The lowest detection plasmid concentration was 3.85 脳 101 copy/ 渭 l. The coefficient of variation of the test was 1. The positive rate of 30 mouse reproductive tract swabs infected with HSV-2 was 96.7%, which was higher than that of routine PCR (80.0%). Conclusion the method of gE2 real-time PCR is sensitive, specific and reproducible for the detection of HSV-2. It can be used for qualitative analysis of HSV-2 and detection of viral load.
【作者单位】： 吉林医药学院检验学院;吉林大学生命科学学院;吉林省电力有限公司电力科学研究院;吉林省产品质量监督检验院;
【基金】：国家自然科学基金青年基金项目(No.31200692) 吉林省卫生厅青年项目(No.2015Q042) 吉林市科技发展计划资助项目(No.20156427)
【分类号】：R440

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