中国产NDM细菌流行现状及我院产KPC-2细菌的分离与耐药性研究

发布时间：2018-10-12 16:43

【摘要】：研究背景和目的细菌耐p-内酰胺类抗生素的主要机制是其产p-内酰胺酶,导致β-内酰胺环抗生素(如青霉素、头孢菌素类抗生素)水解或活性减少。β-内酰胺酶主要包括超广谱p-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)及碳青霉烯酶,产上述酶的细菌广泛播散与流行,使得β-内酰胺类抗生素的耐药问题日益严重,已成为全球的公共卫生问题。尤其是碳青霉烯酶的出现及迅速传播,导致细菌对碳青霉烯类抗生素耐药,几乎突破了临床抗感染治疗的最后一道防线。目前三种主流的碳青霉烯酶：Ambler分类中的A类(KPC)、B类(金属酶)以及D类(OXA-48型)。KPC型碳青霉烯酶于2001年在美国北卡罗来纳首次被发现,到目前已发展了KPC-1～KPC-17共17种亚型,它们之间只有个别氨基酸发生突变,其中KPC-2为存在的主要亚型。KPC型的编码基因blaKPC主要存在于细菌质粒上,可在不同菌种间传播,携有blaKPC质粒的肠道细菌可定植于患者体内并通过交通运输迅速播散,质粒编码的blaKPC现几乎已在全球各地广泛流行。在我国,浙江大学医学院附属第一医院分别于2007年与2011年报道了国内第一例产KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌和第一例产KPC-2型碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌,而我院尚无该型碳青霉烯酶的报道及研究；D类酶中的OXA-48型碳青霉烯酶主要在地中海及欧洲南部国家快速蔓延；而B类碳青霉烯酶,又称金属酶,其中NDM型金属酶可高效水解除替加环素和多粘菌素外的所有抗生素,目前有NDM-1～NDM-10共10个亚型,最常见的是NDM-1型,NDM-1现已波及多个菌种：肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、沙雷氏菌属、柠檬酸杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属等,这些携带有耐药基因blaNDM-1的临床的主要致病菌是严重创伤、败血症、手术后相关感染的巨大潜在威胁,尤其是人们生活中普遍存在的大肠杆菌(社区获得性感染、泌尿系统感染及细菌性腹泻的主要致病菌)被发现可携带耐药基因blaNDM-1.相关报道还指出blaNDM-1基因常与其他β-内酰胺酶基因共存于细菌可转移的基因元件上,使多重耐药性广泛传播,导致携带该类基因的细菌成为全球公共卫生威胁。2010年印度、巴基斯坦、英国等国的流行病学调查结果显示,产MDM-1的肠杆菌科细菌占所检测细菌的1.2%-13%,主要菌种为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根、普罗维登斯菌属;相比国外研究发现,我国blaNDM-1阳性细菌菌种较为局限,见于不动杆菌,且检测率相对较低,浙江大学傅鹰对我国2009年1月至2010年9月的临床分离的12024株革兰阴性杆菌blaNDM-1的筛查结果显示,共筛出13株blaNDM-1阳性的细菌,且均为不动杆菌,总检出率仅为0.1%；军事医学科学院王雪松等对我国2011年1月-10月来自11个省市52家医院的10273份粪便标本进行blaNDM-1基因的筛查结果显示,blaNDM-1的总检出率高达14.8%,对其中120株阳性菌进行鉴定分析发现无肺炎克雷伯菌和大肠杆菌。近年我国临床分离菌产NDM碳青霉烯酶的具体分型、阳性菌种分布,及同时携带其他p-内酰胺酶基因的情况,目前缺乏系统的流行病学研究。本研究的目的是：第一,初步了解近年我国产NDM型的细菌的检出率、具体NDM碳青霉烯酶分型、阳性菌种分布及相关阳性细菌的常见p-内酰胺酶基因的携带情况；第二,对我院未检出blaNDM基因的耐药细菌,进行blaKPC筛查,了解我院blaKPC基因的检出情况、碳青霉烯酶KPC的具体分型及相关阳性细菌的常见p-内酰胺酶基因的携带情况,并进一步研究耐药基因的传播性与耐药性。方法第一部分研究内容：1.菌株收集收集全国38个城市61家医院2009年1月-2014年3月临床分离的1150株耐碳青霉烯类抗生素的无重复的革兰氏阴性菌,包括不动杆菌541株、肺炎克雷伯菌178株、假单胞菌属241株及其他肠杆科细菌190株。菌株来源为便、痰、尿、血、分泌物、导管、引流液等临床标本。送检标本经VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统进行菌株鉴定和抗生素的最低抑菌浓度(MIC)测定,参照CLSI-2013的判断折点。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、阴沟肠杆菌ATCC 700323、铜绿假单胞菌ATCC 27853。2.耐药基因筛查PCR初筛blaNDM基因,阳性菌株进行常见的其他β-内酰胺酶基因筛查,包括碳青霉烯酶基因：blaGES、blaKPC、blaIMI、blaBIC、blaIMP、 blaVIM、blaTMB、blaFIM、blaDIM、blaSIM、blaAIM、blaSMB、blaOXA-23like、 blaOXA-24-like、eblaOXA-48-like 、eblaOXA-58-like 、eblaOXA-143-like 、eblaOXA-235-like 、ESBLs基因：blaCTM-M-1group、blaCTM-M-2group、blaCTM-M-8group、blaCTM-M-9group、blaCTM-M-25group、blaCTM、 blaSHV、blaGES、blaPER、blaVEB、blaOCA-1-like.相关阳性基因的测序比对以确定亚型,并重点对blaNDM基因进行全序测定比对及发育树构建,确定亚型及同源性关系。3.菌种鉴定联合应用特异基因扩增、16SrDNA扩增测序比对、rpoB扩增测序比对及MALDI-TOF质谱技术对blaNDM基因阳性细菌进行菌种鉴定,以确保鉴定到种水平。第二部分研究内容：1.菌株选取我院分离自2013年6月-9月的155株耐碳青霉烯类抗生素的无重复革兰阴性菌,菌株分离自便、痰、尿、血、分泌物、导管、引流液等临床标本,包括不动杆菌、肺炎克雷伯菌、假单胞菌属及其他菌株。以上菌株于第一部分研究中未筛出blaNDM基因。2.耐药基因筛查及传播机制研究PCR初筛blaKPC基因,阳性菌株进行常见的其他β-内酰胺酶基因筛查,包括碳青霉烯酶基因：blaGEC、blaIMI、blaBIC、 blaIMP、blaVIM 、blaTMB、blaFIM、blaSPM、blaDIM、blaGIM、blaSIM、blaAIM、blaSMB、 blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-48-lke、blaOXA-58-like、blaOXA-143-like、blaOXA-235-like ESBLs基因：blacTX-M-lgroup、blaCTX-M-2group、blaCTX-M-8group、blaCTX-M-9-group、 BLaCTX-M-25group、blaTEM、blaSHV、blaGES、blaPER、blaVEB、blaOXA-1-like;相关阳性基因的测序比对以确定亚型,质粒转化实验、Carba NP实验和药敏试验验证阳性耐药基因的传播性。3.菌种鉴定应用特异基因扩增、16SrDNA扩增测序比对及MALDI-TOF质谱技术对blaKPC基因阳性的菌株进行菌种鉴定,以保证鉴定准确性。结果第一部分研究结果：1 .blanDM基因检出情况共检出46株blanDM基因阳性的细菌,总检出率为4%。阳性菌株分离标本包括粪便16株、痰标本16株、尿标本6株、血培养4株、分泌物2株、导管培养1株、引流液1株,来自14个不同城市及15个不同的科室。所有基因均为blaNDM-1型。阳性菌株包括11株汤氏不动杆菌、2株鲁菲不动杆菌、2株鲍曼不动杆菌、3株皮特不动杆菌、1株约翰逊不动杆菌、肺炎克雷伯菌11株,弗氏枸橼酸杆菌6株,大肠埃希菌4株,阴沟肠杆菌、非脱羧勒克菌各2株,解鸟氨酸拉乌尔菌、产气肠杆菌各1株。2.其他β-内酰胺酶基因检出情况blaNDM-1基因阳性菌株其他p-内酰胺酶基因检出结果：2株弗氏枸橼酸杆菌blaKPC-2基因阳性；6株汤氏不动杆菌和2株皮特不动杆菌blaOCA-s58基因阳性；1株弗氏枸橼酸杆菌blaIMP-4基因阳性；1株肺炎克雷伯菌和1株弗氏枸橼酸杆菌blaCTX-M-1 group中的blaCTX-M-15基因阳性,6株肺炎克雷伯菌、2株弗氏枸橼酸杆菌、1株大肠杆菌、1株非脱羧勒克菌、1株阴沟肠杆菌blaCTX-M-1group中的blaCTX-M-3基因阳性；16株blaTEM基因阳性,包括7株肺炎克雷伯菌、4株弗氏枸橼酸杆菌、2株大肠杆菌、2株阴沟肠杆菌及1株非脱羧勒克菌；4株肺炎克雷伯菌、1株阴沟肠杆菌blaSHV-2基因阳性,1株肺炎克雷伯菌blaSHV-5基因阳性；13株细菌blaoxA-1基因阳性,包含4株肺炎克雷伯菌、4株弗氏枸橼酸杆菌、2株汤氏不动杆菌、1株大肠杆菌、1株阴沟肠杆菌及1株非脱羧勒克菌。第二部分研究结果：研究结果发现1株分离自患者痰标本的携带有blaKPC和blaSHV基因的肺炎克雷伯菌和1株分离自患者尿标本的携带blaKPC基因的铜绿假单胞菌。对阳性基因扩增测序比对后发现blaKPC均为blaKPC-2型,blaSHV为blASHV-11型。通过电转化实验证实了blaKPC-2基因的可转移性,同时应用CarbaNP实验、药敏试验发现该基因可于转化子中成功表达A型β-内酰胺酶,导致细菌对β-内酰胺类抗生素耐药。结论我国近年产NDM-1菌株的检出率高达4%,远远大于2009-2010年的0.1%,同时携带blaNDM-1的细菌不再局限于不动杆菌属,而是广泛涉及肠杆科细菌,包括肺炎克雷菌、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌等。对blaNDM-l基因的全序扩增及对应氨基酸序列的发育树构建发现,检出的blaNDm-1基因序列表达的氨基酸序列完全一致,同源性一致。我国携带blaNDM-1的细菌所含的耐药基因复杂,可同时携带多种其他β-内酰胺酶基因：blACTX-M-1group、blaOXA-1-like、blaSHV、blaIMP、 blaKPCc及blaOXA-58-like的一个或多个。我院检测的155株耐药菌株未检出blaNDM基因,但发现可随质粒转移的碳青霉烯酶基因blaKPC-2,该基因能够使转化子成功表达A型p-内酰胺酶,导致细菌对β-内酰胺类抗生素耐药,同时发现我院blaKPC-2基因可与blaSHV-11基因共同存在于细菌中,只是blaSHV-11并未在转化子中表达,考虑该基因可能位于细菌染色体上或不位于携带的blaKPCt-2的质粒上。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.5

【共引文献】