【摘要】:嘌呤生物碱是一类小分子量的含氮化合物,广泛分布于自然界多种植物中。该类化合物的药理作用复杂多样,已有多种化合物被开发为临床药物,如咖啡因,茶碱等。因此,建立嘌呤生物碱类化合物的生物样品含量的检测方法具有重要意义。目前,对嘌呤生物碱类化合物在生物样本中的常用检测方法,包括HPLC、LC-MS等,需要较为繁琐复杂的样品前处理过程,仪器设备较为昂贵,且对样品检测无法做到高通量的同时检测。而利用嘌呤生物碱类化合物的单克隆抗体建立的酶联免疫吸附法(enzeyme-linked immunosorbent assay, ELISA),具有检测生物学样品前处理简单、仪器设备价格低廉、实验耗材成本低的特点,可以对样品中的微量、痕量嘌呤生物碱成分进行高通量同时检测。本课题选择嘌呤生物碱类化合物茶碱-7-乙酸(theophylline-7-acetic acid,7-TAA)作为半抗原,制备了抗7-TAA的单克隆抗体,并建立了7-TAA、theacrine、咖啡因的ELISA法。分别利用ELISA法检测小鼠血清中的7-TAA含量、小鼠血液和脑组织中的theacrine含量和不同市售药品中的咖啡因含量。本研究所建立的7-TAA、theacrine、咖啡因的ELISA法,对生物样品中的7-TAA、theacrine.咖啡因的高通量、快速检测具有重要意义。[目的]1.制备抗茶碱-7-乙酸单克隆抗体。2.利用抗茶碱-7-乙酸单克隆抗体,分别建立7-TAA、theacrine和咖啡因的ELISA法。3.分别利用ELISA法检测小鼠血清中的7-TAA含量、小鼠血液中的theacrine含量,以及不同市售药品中的咖啡因含量。[方法]1.采用活泼酯法合成7-TAA的人工抗原,免疫后进行血清抗体检测。经过细胞融合后,筛选并单克隆化分泌抗7-TAA抗体的杂交细胞瘤。采用辛酸硫酸铵法纯化腹水,制备抗7-TAA单克隆抗体,考察抗体特异性。2.优化包被原浓度、一抗工作浓度、线性检测范围,进行方法学考察及加样回收率检测,建立7-TAA、theacrine和咖啡因的ELISA法。3.采用ELISA法检测小鼠血液中的7-TAA含量、theacrine含量和市售药品中的咖啡因含量,并与常规HPLC法检测结果比较。4.雄性昆明小鼠10只,按剂量45 mg·kg-1给小鼠灌胃给药theacrine,分别于给药后10个时间点,采取尾尖取血方法取血10μg,溶于90μL磷酸盐缓冲液,采用ELISA法考察theacrine在小鼠血液中的药代动力学特征。5.雄性昆明小鼠10只,按剂量45 mg·kg-1给小鼠灌胃给药theacrine,给药后35 min断头,分别取皮质、海马、下丘脑、脑干和小脑,称重后加入1.0 mL PBS缓冲液,匀浆离心取上清,采用ELISA法检测小鼠脑内亚器官的theacrine含量,初步探析theacrine在小鼠脑内亚器官的分布特征。[结果]1.成功制备7-TAA人工抗原,经MALDI-TOF-MS检测,计算其偶联比约为23。2.成功获得分泌抗7-TAA抗体的单克隆细胞株C1183,所分泌抗体特异性强,与theacrine和咖啡因的交叉反应率为34.0%和0.3%,与茶碱、可可碱、1,3,9-三甲基尿酸无明显交叉反应(交叉反应率均0.01)3利用抗7-TAA单克隆抗体建立了7-TAA酶联免疫吸附法。线性竟争范围为46.8ng·mL-1-3000 ng·mL-1灵敏度为528.43 ng·mL-1,稳定性好,孔间差变异系数7.8%,板间差变异系数8.5%,平均加样回收率为99.59%。小鼠血液中7-TAA含量的检测结果为1188.97±44.9、812.31±43.0、284.70±16.5ng·mL-1,与HPLC法检测结果相关性高。4利用抗7-TAA单克隆抗体建立了theacrine酶联免疫吸附法。线性竞争范围为156.25ng·mL-1-100μmL-1,灵敏度为1547.6 ng·mL-1,稳定性好,孔间差变异系数8.0%,板间差变异系数7.7%,平均加样回收率为99.87%。小鼠血液中theacrine含量的检测结果为1254.61±68.8、696.02±33.36、439.57±13.15ng·mL-1,与HPLC法检测结果相关性高。利用1theacrine酶联免疫吸附法检测小鼠血液中的theacrine代谢曲线,发现在0.5 h时,theacrine在血液中的药物浓度达到峰值,2.0 h时出现第二个吸收峰。利用theacrine酶联免疫吸附法检测theacrine在小鼠脑内亚器官的分布,发现下丘脑的theacrine含量最高。5.利用抗7-TAA单克隆抗体建立了咖啡因酶联免疫吸附法。线性竞争范围为7.0μg·mL-1-500μg·mL-1,灵敏度为165.34 μg·mL-1,稳定性好,孔间差变异系数8.7%,板间差变异系数6.7%,平均加样回收率为100.5%。市售药品中的咖啡因含量的检测结果为15.003±0.55、30.294±0.91、32.045±0.78mg,与HPLC法检测结果相关性高。[结论]活泼酯法合成的7-TAA人工抗原免疫效果良好,经细胞融合后成功制备抗7-TAA单克隆抗体,建立了7-TAA、theacrine和咖啡因的酶联免疫吸附法,可用于检测小鼠血清中的7-TAA含量、小鼠血液和脑组织中的theacrine含量和不同市售药品中的咖啡因含量。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R446.6
【参考文献】
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2294774
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