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肺炎链球菌热休克蛋白GrpE的初步晶体学研究

发布时间:2018-11-27 19:06
【摘要】:目的 热休克蛋白GrpE是热休克蛋白超家族70重要成员之一,被认为是一种负性调控基因。该基因在肺炎链球菌的感染中有相关作用。对肺炎链球菌热休克蛋白GrpE进行克隆表达,纯化及热稳定性测定,以便于进一步分析肺炎链球菌感染的分子机制。方法设计特异性引物,通过PCR技术扩增目的基因。构建pW28-GrpE重组表达质粒。在大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli) B834中获得可溶性上清表达。利用Ni2+-NTA亲和层析柱、DEAE阴离子交换层析柱、Hiload Superdex 75凝胶层析柱对靶蛋白进行纯化。TSA法测定GrpE热稳定性,气相扩散法获得蛋白质晶体。结果重组构建质粒pW28-GrpE可以在表达菌E.coli B834中获得可溶性上清表达。GrpE蛋白具有较高纯度(95%以上),目的蛋白在溶液中以二聚体形式存在。发现重组GrpE蛋白在20 mM盐浓度、pH6.0缓冲液中有较高热稳定性。获得衍射能力为5A的蛋白质晶体。结论 利用蛋白质表达纯化的经典技术,获得了高表达、高纯度的GrpE蛋白。为下一步蛋白质晶体的优化及相关基础研究奠定了基础。
[Abstract]:Objective Heat shock protein (GrpE) is one of the important members of heat shock protein superfamily 70 (HSP70) and is considered to be a negative regulatory gene. This gene plays a related role in the infection of Streptococcus pneumoniae. In order to further analyze the molecular mechanism of Streptococcus pneumoniae infection, the GrpE of Streptococcus pneumoniae was cloned and expressed, purified and determined in thermal stability. Methods specific primers were designed and the target gene was amplified by PCR. The recombinant expression plasmid of pW28-GrpE was constructed. The soluble supernatant was expressed in Escherichia coli (Escherichia coli, E.coli B834. The target protein was purified by Ni2 NTA affinity chromatography column and DEAE anion exchange chromatography column, Hiload Superdex 75 gel chromatography column. The thermal stability of GrpE was determined by TSA method, and protein crystals were obtained by gas phase diffusion. Results the recombinant plasmid pW28-GrpE could be expressed in the soluble supernatant of E.coli B834. The GrpE protein had high purity (more than 95%), and the target protein existed in the form of dimer in solution. It was found that the recombinant GrpE protein had high thermal stability in pH6.0 buffer at 20 mM salt concentration. Protein crystals with diffraction power of 5A were obtained. Conclusion GrpE protein with high expression and high purity was obtained by using the classical technique of protein expression and purification. It lays a foundation for the further optimization of protein crystals and related basic research.
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R440

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本文编号:2361754

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