小分子IAP抑制剂AT-406对宫颈癌细胞的放疗增敏作用及其机制研究

发布时间：2019-04-01 17:59

【摘要】：目的:宫颈癌辐射抵抗与肿瘤细胞凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis proteins,IAP)的表达相关,本研究旨在观察小分子IAP抑制剂AT-406对常、乏氧宫颈癌细胞的辐射增敏效应,探讨给药浓度及时序对辐射增敏作用的影响,阐明AT-406放射增敏及改善乏氧微环境可能的机制。方法:(1)CCK-8法检测AT-406单独给药时对人类宫颈癌细胞株Hela和Siha的细胞增殖抑制作用,绘制出细胞抑制率曲线,计算AT-406对肿瘤细胞作用的IC50值。(2)克隆形成实验观察不同药物浓度的AT-406对常氧和乏氧Hela和Siha细胞的放疗增敏作用,比较单纯照射以及药物与辐射联合后细胞的成瘤能力,观察对AT-406宫颈癌放射增敏性的影响。(3)在常氧和乏氧微环境中,采用流式细胞法检测不同浓度AT-406单纯给药、单纯辐照(8 Gy)以及AT-406+辐照联合作用后Hela和Siha的细胞凋亡率情况。(4)常氧和乏氧条件下利用细胞免疫荧光染色动态观察AT-406对不同剂量的辐射引起宫颈癌细胞DNA双键断裂的影响。(5)免疫印迹分析(Western Blotting)检测AT-406按药物浓度梯度给药后Hela和Siha细胞中IAP家庭相关蛋白(c IAP1、c IAP2及XIAP)的变化,并研究蛋白表达量与给药时间的关系;同时通过检测凋亡及乏氧相关通路蛋白探讨AT-406对宫颈癌细胞乏氧增敏可能的机制。(6)Caspase-3,-8,-9活性测定明确AT-406单纯给药、单纯辐照(8 Gy)以及AT-406+辐照联合作用对Hela和Siha细胞凋亡通路的影响。结果:(1)不同浓度的AT-406对Hela和Siha细胞均呈量效性和时效性的生长抑制作用,24 h AT-406对Hela和Siha细胞的IC50值分别为83.32和64.26μM。(2)考虑临床常规放疗剂量的实用性及参考文献资料,后续实验选取8 Gy为放疗剂量,AT-406选取IC20的高、低两个药物浓度(5和10μM)进行比较,联合治疗中采用先药后放作用时序。(3)克隆形成实验发现,常氧条件下单纯辐射与射线联合AT-406作用均能抑制两种宫颈癌细胞集落形成,联合组抑制作用更加明显,但AT-406对Siha细胞的抑制效应依赖更高的药物浓度,10μM AT-406联合放疗时Hela和Siha细胞的SER分别为1.81和1.43(P0.05);而乏氧条件下,AT-406仍能促进辐照对两种宫颈癌细胞集落形成的抑制作用,且较常氧时更加明显,AT-406高药+辐照组Hela和Siha细胞的SER分别为2.07和1.72,P0.05。(4)流式细胞检测对照组、AT-406单纯给药组、单纯照射组及AT-406+照射联合组的细胞凋亡率,单独放射与AT-406联合射线作用均能引发两种宫颈癌细胞凋亡,联合组促凋亡作用更加明显,且具有时间、浓度依赖性,AT-406对Siha细胞的放疗增敏作用在乏氧微环境下更加明显。(5)免疫荧光染色证实AT-406处理后的宫颈癌细胞更易因X射线造成DNA双链断裂,且自我修复能力降低。(6)Western Blotting法检测AT-406不同药物浓度作用下宫颈癌细胞IAP家族蛋白表达情况,结果表明AT-406在常氧条件下可以使Hela细胞中cIAP1蛋白的表达降低,乏氧时可同时下调cIAP1和XIAP蛋白,而对于Siha细胞AT-406仅能在乏氧时降低XIAP的表达,在给药后12-24 h内AT-406对IAP家族蛋白的抑制作用最为明显;结合对乏氧相关通路蛋白的检测,AT-406在乏氧宫颈癌细胞中的作用可能与STAT3磷酸化的抑制有关。(7)Caspase活性检测表明AT-406的促凋亡作用同时依赖外源性和内源性两条凋亡通路。结论:(1)AT-406具有明显的放射增敏作用,能增强X射线对Hela和Siha细胞增殖的抑制作用,且增敏作用存在药物浓度依赖性。(2)AT-406对乏氧的宫颈癌细胞同样具有较强的放射增敏作用。(3)AT-406的放疗增敏作用可能同时依赖于对IAP家族蛋白表达和STAT3磷酸化的抑制。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33;R730.55

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