表皮生长因子受体调控内毒素血症中HMGB1诱导的TNF-alpha释放的机制研究

发布时间：2019-04-26 09:11

【摘要】：内毒素血症是临床常见的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)。严重创伤、烧伤、胃肠道黏膜缺血坏死、机体免疫力下降,甚至机械通气均有可能导致内毒素血症的发生。而在围手术期,内毒素血症更是常见。如果不能及时很好地处理和治疗,发展成严重脓毒症,导致脓毒性休克、急性心功能衰竭、急性肺损伤、急性肾损伤甚至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),最后多器官衰竭(multiple organ failure,MOF)的一系列失控性炎症反应,常常是重症监护室(intensive care unit,ICU)导致病人死亡的主要原因。研究内毒素血症和脓毒症的发病机理,寻求合适的治疗方法仍然是目前卫生事业工作者最关注的问题之一。高迁移率族蛋白 B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)是目前被认为在脓毒症中最重要的"晚期"炎症因子,其外周血表达水平对脓毒症的预后有重要的指导意义。内毒素血症主要的致病因素内毒素也称脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),能通过结合模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)如Toll样受体(Toll like receptor,TLR)生成多种细胞炎症因子,如肿瘤坏死因子 alpha(tumor necrosis factor alpha,TNF-a)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β、IL-8等,也可以趋化细胞核中的HMGB1分泌到细胞外。胞外的HMGB1能通过结合糖化终末产物受体(receptor for advanced glycation end product,RAGE)、TLR2 和 TLR4 等 PRR 受体激活 MAPK、PI3K/Akt、NFκB信号通路,进一步促进受损细胞生成炎症因子,形成炎症级联放大效应。当机体缺血、缺氧、创伤时,坏死的细胞也能直接释放HMGB1,导致非细菌性SIRS。关于HMGB1在炎症反应中的作用已成热点之一。而近年来,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)参与炎症反应信号通路的调控作用也逐渐被发现并受到重视。EGFR是人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor,HER)家族成员之一。HER 家族共有四个成员,除了 EGFR还有HER2、HER3、HER4,这些受体具有酪氨酸激酶活性。目前发现LPS结合TLR4能够促进一种金属转化酶肿瘤坏死因子α转化酶(tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme,TACE)释放,TACE 进一步裂解转化生长因子-α(transforming growth factor-alpha,TGF-α)游离释放。TGF-α是 EGFR的配体,与EGFR结合后,EGFR能与自身或家族成员形成二聚体并导致自身磷酸化参与信号转导作用。HER2目前没有发现其相应的配体,被认为是一种孤受体。EGFR主要与HER2形成异型二聚体,研究发现相比同型二聚体,这种结合在信号转导中效率更高。EGFR的磷酸化能激活下游的MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路,最终激活NFκB转录因子或者SP1(specifcity protein-1)转录因子,促进IL-8、IL-1等炎症因子释放。可以看出,HMGB1与EGFR在参与炎症反应具有共通性。两者都能通过TLR信号通路激活下游的MAPK、PI3K/Akt、NFκB等信号通路。但是EGFR的激活是否介导TNF-α的生成释放,目前没有明确结论。而且对于HMGB1导致的炎症反应的研究中,EGFR是否参与其炎症反应机制,目前几乎没有相关的研究工作。我们在前期的研究工作中发现,使用EGFR抑制剂PD168393和厄洛替尼(Erlotinib)能明显减少LPS诱导的心肌细胞的TNF-α的释放。证实了 EGFR确实参与炎症反应中TNF-α的生成。同样对多种细胞使用EGFR抑制剂预处理,能明显减少HMGB1刺激后TNF-α的生成。这为我们本研究提供充分的依据。本研究采用两种EGFR抑制剂PD168393和Erlotinib,对体外培养的THP1细胞和原代小鼠骨髓衍生巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMM)进行两方面的研究:1、探讨表皮生长因子受体是否参与HMGB1诱导的TNF-a的生成;2、探讨表皮生长因子受体可能参与HMGB1诱导TNF-α生成的机制。材料与方法1.细胞毒性及活力试验:CCK-8(cell counting kit-8)法测定不同浓度EGFR抑制剂PD168393和Erlotinib的细胞毒性,选择合适的浓度给药;同样用CCK-8法检测HMGB1给药后24小时和48小时不同时间点细胞的活力。2.实验分组:将培养后的THP1细胞或者BMM细胞给予抑制剂预处理时分为 6 个组:对照组(Ctrl),Erlotinib 组(Er,20μM),PD168393 组(PD,10μM),HMGB1 组(HI,1μg/ml),HMGB1+Erlotinib 组(H1+Er)和 HMGB1+PD168393组(H1+PD),使用抑制剂预处理30min后再使用HMGB1刺激4h,另外预实验中增加一组HMGB1煮沸后给药组,排除HMGB1中可能的LPS干扰。3.siRNA转染沉默EGFR和HER2:PD168393是一种不可逆选择性抑制剂,既可以抑制HER2受体,也可以抑制EGFR受体。为了明确HMGB1导致TNF-a的生成是由EGFR参与还是两者皆有参与,我们对细胞siRNA沉默EGFR和HER2的mRNA表达后再进行HMGB1刺激。实验分为6组:空白对照组(Ctrl)、Lipo2000转染试剂对照组(Lipo2000)、阴性对照组(NC)、HMGB1组、HMGB1+si-EGFR组、HMGB1+ si-HER2组。细胞转染24-48小时后使用HMGB1刺激4h。4.ELISA法检测细胞上清TNF-a的表达:收集上清,使用酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测 TNF-a 表达水平。5.PCR法检测细胞中EGFR和HER2的mRNA表达:细胞提取总RNA反转录后,通过实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase Chain Reaction,Q-PCR)检测 EGFR 和 HER2 mRNA 的表达情况。6.western blot检测细胞磷酸化蛋白EGFR、ERK1/2和P38表达:给药4小时后,收集细胞并使用磷酸盐缓冲液清洗2遍,使用western blot法检测细胞磷酸化蛋白EGFR、ERK1/2和P38表达。7.统计学分析:采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析,计量资料均数±标准差((?)±s)表示。不同时间点采用重复测量方差分析;两组比较采用两独立样本t检验;多组比较采用单因素方差分析(one wayANVOA),组间比较有显著差异时,方差齐用LSDt检验,方差不齐用Dunnett'st检验。P0.05差异有统计学意义。作图使用GraphPad Prism 5.0作图软件。实验结果:1.HMGB1刺激THP1细胞磷酸化EGFR蛋白表达实验分为control组和HMGB1组。HMGB1组给予1μg/mlHMGB1刺激1小时,control组给予等体积生理盐水对照。western blot检测细胞磷酸化EGFR的表达,与control组相比,HMGB1组磷酸化EGFR表达明显增加,有统计学意义(P0.05)。表明HMGB1刺激后能转激活THP1细胞中的EGFR,导致EGFR磷酸化。2.不同浓度PD168393和Erlotinib的细胞毒性比较在THP1细胞中,PD168393最高浓度组(20μM)与对照组以及其他浓度组相比,细胞活力明显下降(P0.05);Erlotinib50μM组和100μM组两个浓度组对照组以及其他低浓度组相比,细胞活力下降且有统计学意义(分别为P0.05、P0.01)。根据结果我们选取 PD168393 10μM 和 Erlotinib 20μM 进行实验。3.HMGB1给药对细胞活力的影响THP1细胞分别经EGFR抑制剂Erlotinib和PD168393预处理30min后,给予1μg/ml HMGB1刺激继续培养24小时和48小时。CCK-8结果显示24小时和48小时两个水平细胞活力差异有显著意义(P0.001),分组与时间有交互作用(P0.001)。HMGB1刺激随着时间延长,增殖能力提高(P0.05)。同一时间组间比较,与对照组相比,HMGB1组细胞增殖能力在24小时和48小时均显著提高(P0.01);与HMGB1组相比较,HMGB1+Erlotinib组在24小时和48小时细胞活力下降均有统计学意义(P0.01),HMGB1 +PD168393组24小时细胞活力无显著差异(P0.05),而48小时有显著差异(P0.01)。4.EGFR抑制剂对HMGB1诱导的TNF-α的表达水平影响在THP1细胞刺激4小时后,对照组TNF-α表达水平为14.85±8.52pg/ml,HMGB1 组 TNF-α释放显著增加为 4192.93±688.41 pg/ml(P0.01)。两种 EGFR抑制剂预处理后均能抑制部分TNF-α的释放(P0.01),使TNF-α浓度水平分别降至 474.78±25.43pg/ml(Erlotinib)、1333.48±105.85pg/ml(PD 168393);PD168393抑制HMGB1刺激TNF-α的生成,效果比使用Erlotinib好(P0.01)。与HMGB1组比较,HMGB1煮沸后给药TNF-α的表达明显较低(177.96±14.50pg/ml,P0.01),说明HMGB1导致的TNF-α的生成主要是由于HMGB1本身导致的,并不是由于HMGB1混有LPS导致的。在BMM细胞中,得到的结果与THP1细胞相似。细胞经HMGB1刺激后,TNF-α水平从14.14±4.21pg/ml上升到1728.41±265.35pg/ml,差异具有统计学意义(P0.01)。使用抑制剂能减少TNF-α生成约50%,有统计学意义(P0.05)。而两种抑制剂抑制效能无显著差异(P0.05)。5.siRNA对HMGB1诱导的TNF-α的表达水平的影响THP1细胞分别转染EGFR和HER2的siRNA后检测转染效率达到50%-60%为转染成功。给予HMGB1刺激4小时,检测细胞上清TNF-α的表达水平。结果显示与control组相比,HMGB1组、HMGB1+si-EGFR组和HMGB1+si-HER2组TNF-α表达增高,结果有统计学意义(P0.001)。相比HMGB1 组,HMGB1+si-EGFR 组和 HMGB1+si-HER2 组沉默 EGFR 或 HER2 mRNA表达后,部分TNF-α释放能被抑制,有统计学意义(P0.05)。HMGB1+si-EGFR组和HMGB1+si-HER2组抑制TNF-α生成的水平相当,无显著性差异(P=0.307)。6.HMGB1对ERK1/2和P38磷酸化的影响western blot检测细胞给药后磷酸化蛋白ERK1/2和P38。结果显示与对照组相比,HMGB1刺激细胞后4小时,ERK1/2和P38的磷酸化水平明显提高(P0.01)。与 HMGB1 给药组相比,HMGB1+Erlotinib 和 HMGB1+PD168393两组ERK1/2的磷酸化水平能明显被抑制,差异有统计学意义(P0.01),其中HMGB1+PD168393组比HMGB1+Erlotinib组ERK1/2磷酸化水平抑制更明显(P0.01);与HMGB1给药组相比,HMGB1+PD168393组磷酸化P38表达水平有显著性差异(P0.01),而HMGB1+Erlotinib组无统计学差异(P=0.194)。HMGB1+PD168393组相比HMGB1+Erlotinib组,磷酸化P38表达水平降低明显,有统计学意义(P0.05)。结论:1、HMGB1能诱导THP1细胞、原代小鼠骨髓衍生巨噬细胞TNF-α的生成。2、表皮生长因子受体EGFR和HER2均参与HMGB1诱导的TNF-α生成。3、HMGB1诱导细胞TNF-α生成,其可能机制是通过激活EGFR和HER2,进一步激活MAPK信号途径的ERK1/2和P38,导致ERK1/2和P38的磷酸化,调节TNF-α的转录促进TNF-α生成。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R459.7

【相似文献】