住院患者粪便中耐碳青霉烯G-杆菌调查及耐药机制研究

发布时间：2019-07-31 14:09

【摘要】：研究背景随着抗生素的广泛使用,碳青霉烯类抗生素已成为治疗临床G-杆菌感染的最后一道防线,耐碳青霉烯G-杆菌的快速传播越来越引起全球关注。产碳青霉烯酶是这类细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因,碳青霉烯酶是指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类β-内酰胺酶,包括Ambler分子分类中的A、 B、D三类酶。大多数碳青霉烯酶基因位于质粒、整合子等可转移性基因元件上,可通过质粒或转座子在相同或不同菌种间传播。耐碳青霉烯G-杆菌不仅对β-内酰胺类抗生素耐药,同时多数也对喹诺酮、氨基糖苷等其他类抗生素耐药,从而表现出多耐药甚至泛耐药的特性。耐药基因转移元件在传播耐药性中起了重要作用。整合子、插入序列共同区(insertion sequence common region, ISCR)是一种广泛存在于细菌基因组中的可移动基因元件,通过捕获耐药基因盒而导致细菌耐药性迅速产生及扩散,复杂性整合子是ISCR1与Ⅰ类整合子的串联形式,其结构的特殊性使复杂性整合子可以水平转移更多的耐药基因,且该结构常位于接合性质粒上利于耐药基因的水平传播,对临床抗感染治疗造成严重威胁。人体肠道是各种耐药细菌和耐药基因的储存场所和感染来源,因此粪便可通过污染周围环境造成耐药菌的广泛传播,美国疾病预防控制中心推荐粪便标本检测来监测耐碳青霉烯G-杆菌的携带者。本研究调查了住院患者粪便中的耐碳青霉烯G-细菌携带率,对耐碳青霉烯G-细菌进行属种鉴定和药敏试验,并对其耐药机制进行研究,检测了常见的碳青霉烯酶基因,ESBL基因,及常见的耐药基因转移元件：整合子和ISCR,并进一步对整合子和ISCR携带的耐药基因盒进行检测和分析,阐明耐碳青霉烯G-细菌的耐药机制,为临床更好的防治提供信息。因产NDM超级细菌之前已经做了相关研究,本研究主要针对余下的非产NDM耐碳青霉烯G-细菌展开。研究方法1. 标本收集收集南方医院2013年7月至12月之间住院患者粪便标本5000份。在含2 mg/1美罗培南麦康凯平板上培养分离耐碳青霉烯的革兰阴性杆菌。并进行分纯、转种和保存,用试剂盒提取细菌全基因组DNA。2. 菌株属种鉴定及药敏试验利用BD phoenix 100全自动微生物鉴定仪器对耐碳青霉烯的革兰阴性杆菌进行属种鉴定和MIC药敏试验。并同时用K-B纸片法法对亚胺培南和美罗培南的药敏结果加以确认。3.16S rRNA基因测序利用标准菌株和临床常见菌株建立16S rRNA基因序列分析方法,对细菌进行分子生物学鉴定。利用这一方法对南方医院三年来的临床难鉴定细菌进行鉴定,并进一步扩展到血培养标本的应用检测。对粪便中分离的耐碳青霉烯的革兰阴性杆菌扩增16S rRNA基因并测序,经过序列分析进行其属种的确认,并与BD phoenix 100的鉴定结果进行比较。4. 常见碳青霉烯酶基因的检测PCR检测粪便中分离的耐碳青霉烯的革兰阴性杆菌的常见碳青霉烯酶基因KPC、VIM、IMP、SPM、GES、SIM、GIM、OXA-48基因,对于不动杆菌加测OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、 OXA-58-like四群OXA类的碳青霉烯酶基因,将阳性PCR产物进行测序验证并确定其亚型。5. ESBL基因的检测PCR检测粪便中分离的耐碳青霉烯的肠杆菌科细菌的常见ESBL基因TEM、SHV、CTX-M基因,将阳性PCR产物进行测序验证并确定其亚型。6. Ⅰ类整合子及其基因盒检测PCR先扩增Ⅰ类整合子的保守区整合酶1基因,再对阳性菌株进一步扩增Ⅰ类整合子的可变区。根据限制性内切酶HinfI和RsaI酶切可变区的图谱对不同菌株的可变区初步分类,同一属种不同的酶切谱型挑选2株进行可变区测序,分析序列的同源性得出各可变区的耐药基因盒组合。7. ISCR及其基因盒检测先利用PCR扩增orf513基因,再对阳性菌株进一步扩增其携带的基因盒。根据限制性内切酶HinfI和RsaI酶切基因盒的图谱对不同菌株的可变区初步分类,同一属种不同的酶切谱型挑选2株进行可变区测序,分析序列的同源性得出各可变区的耐药基因盒组合。8. 复杂性整合子检测根据复杂性整合子的结构特点,对于Ⅰ类整合子可变区和ISCR1可变区同时阳性的细菌,PCR扩增两者的串联保守区,再对阳性菌进一步设计引物检测两者的串联可变区,再进一步对串联可变区测序,分析序列的同源性得出复杂性整合子耐药基因盒组合。研究结果1. 耐碳青霉烯细菌的分离和属种分布从5000份粪便标本中共筛查到389株耐碳青霉烯G-杆菌,包括58株肠杆菌科细菌和331株非发酵G-菌(含60株嗜麦芽窄食单胞菌,271株其他非天然耐碳青霉烯非发酵菌),其中96株为NDM阳性菌株,其余293株细菌,包括36株肠杆菌科细菌和257株非发酵G-菌(含60株嗜麦芽窄食单胞菌,197株其他非天然耐碳青霉烯非发酵菌)。2. 细菌的药敏结果BD phoenix 100给出了以下10种抗生素的MICs值,包括阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南、粘菌素、复方新诺明、氯霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和四环素。根据CLSI文件M100-S23对细菌进行药敏结果判断,非发酵菌和肠杆菌科细菌这两组细菌对于上述这些药物的敏感率不同。非发酵菌的敏感率分别为88.24%、25.82%、 0、0、100.00%、26.89%、X、16.23%、45.76%、35.44%；而肠杆菌科的敏感率为56.36%、8.76%、0、0、X、4.12%、25.69%、17.58%、29.72%、22.34%(X表示CLSI没有相应的药敏参考折点)。K-B法检测的IPM和MEM与仪器法药敏结果一致。3.16S rRNA基因序列分析方法的应用 建立16S rRNA基因序列分析方法,用于220株难鉴定细菌的属种鉴定,其测序结果共分为45个种属,其中8株为第一次在中国报道,2株为第一次在国际报道。100例血培养标本中发现10例16S rDNA和仪器法鉴定结果不一致,233株粪便分离的耐碳青霉烯G-杆菌中,27例非发酵菌的16S rDNA和仪器法鉴定结果不一致,以16SrDNA鉴定结果为准,其他结果均一致。4. 碳青霉烯酶基因检测结果在233株耐碳青霉烯G-杆菌中共检出IMP基因阳性菌株41株,分3种亚型,IMP-1,IMP-4,IMP-9。VIM基因阳性菌株31株,全部为VIM-2型。并有菌株同时携带IMP和VIM基因。IMP和VIM基因阳性菌株主要分布与假单胞菌属中,也可见于肠杆菌科和部分非发酵菌。其余基因blaKPc、blaGIM、blaSpM、blaSIM、blaGES、bla OXA-48均未检出阳性菌株。26株不动杆菌的OXA基因检测,20株含blaOXA-23、5株含blaOXA-24、19株含blaOXA-51、7株含blaOXA-58,同时有菌株同时携带多种OXA基因。5.ESBL基因检测结果36株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌中,21株含blaTEM,16株含blaSHV,7株含blaCTX-M,且有细菌同时携带两种甚至三种ESBL基因。6. Ⅰ类整合子及其基因盒检测结果233株耐碳青霉烯细菌中Ⅰ类整合子阳性135株,其中97株可变区阳性菌株中共发现37种不同的基因盒排列组合。这37种基因盒组合中共包括40种不同的基因盒,分别是氨基糖苷类耐药基因：aadA1,aadA2,aadA4,aadA5,aadA13,aadA24,aadB,aac(6')-Ⅱ,aacA4, aacA4-like,aacA6,aacA7;p-内酰胺酶耐药基因：blaoXA-10, blaoXA-21, blaoXA-30, blaoXA-101, blaPSE-1, blaVIM-2,blaIMP-1, blIMP-4, blaIMP-9;甲氧苄啶耐药基因：dfrA1, dfrA5,dfrA12, dfrA14, dfrA15,dfrA17,dfrA25, dfrA27;氯霉素耐药基因：cmlA1, cmlA8, catB2, catB8, catB-like;利福平耐药基因arr-3。另外有四个基因盒orflⅠ、orfⅢ、orfC、orfF尚未证实与耐药基因有关。在本实验的37种不同的基因盒组合中,有7种排列为在所有细菌属种首次报道,2种在相应细菌属种中首次报道。在1株阴沟肠杆菌中检测到blaIMP-4基因盒,在恶臭假单胞菌、无色杆菌和1株Cupriavidus pauculus中检测到blaIMP-1基因盒,在铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌中检测到blaVIM-2基因盒。7.ISCR及其基因盒检测结果233株耐碳青霉烯细菌中ISCR1阳性93株,在41株可变区阳性菌株中共发现9种不同的基因盒排列组合,这9种基因盒组合中包括不同的基因盒,分别是是氨基糖苷类耐药基因：aadA2, aacA6;p-内酰胺酶耐药基因：blaPER-1,blaCTX-M-9;甲氧苄啶耐药基因：dfrA10,dfrA12, dfrA16;喹诺酮耐药基因：qnrA1,qnrB2,qnrB6;利福平耐药基因arr-3。8.复杂性整合子检测结果Ⅰ类整合子和ISCR1串联形成的复杂性整合子共检出6株细菌4种类型,分布在不动杆菌、无色杆菌、恶臭假单胞菌、产气肠杆菌中。结论1. 入院患者粪便中携带一定量的碳青霉烯耐药革兰阴性杆菌,这些耐碳青霉烯革兰阴性杆菌分布于临床常见致病菌中,甚至有临床罕见菌,如C. gilardii,这些细菌可能定植于人类肠道粪便中,借助环境或其他因素进行传播,对这些耐药菌的监测至关重要。2.16S rRNA基因序列分析方法作为一种辅助鉴定临床细菌的方法,可以弥补传统方法的局限而用于细菌的鉴定。本研究中BD Phoenix100全自动微生物鉴定仪难以准确鉴定的细菌,其鉴定结果ID值小于90%或者无ID值,利用16SrDNA序列分析方法,能准确阐明株细菌的属种。通过对16S rDNA基因序列分析和BD Phoenix100全自动微生物分析仪鉴定结果对比,发现BD Phoenix100对某些非发酵菌鉴定结果不准确。16S rRNA基因序列分析方法为细菌分类和鉴定的金标准。3. 碳青霉烯酶基因检测碳青霉烯酶携带率高,IMP和VIM基因阳性菌株主要分布与假单胞菌属中,也可见于肠杆菌科和部分非发酵菌,不动杆菌碳青霉烯酶基因以OXA型基因为主,对碳青霉烯酶基因的检测有助于了解不同细菌的耐碳青霉烯机制。4. 整合子检测出40种不同的基因盒,包括碳青霉烯酶基因盒,37种不同的基因盒排列,其中有7种为在所有属种在首次报道,2种在相应属种中首次报道。ISCR检测出9种不同的基因盒排列。复杂性整合子检出4种不同类型。可移动基因元件的检测对细菌多重耐药的传播及作用机制有着重要作用。
【图文】：

氏嗜胆菌ＣＢｉｌｏｐｈｉｌａｗａｄｓｗｏｒｔｈｉａ）！株、胎儿弯曲菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ邋ｆｅｔｕｓ生姨二氧化碳嗜纤维菌（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ邋ｓｐｕｔｉｇｅｎａ）ｌ株、代尔夫特食酸（Ｄｅｌｆｔｉａ邋ｓｐ．）１０株、害肺小杆菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ邋ｐｎｅｕｍｏｓｉｎｔｅｓ）！株、侵烛艾ｎｅｌｌａ邋ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）８邋株、流感嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）１４邋株、奥菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ邋ｏｓｌｏｅｎｓｉｓ）３邋株、非液化莫拉菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ邋ｎｏｗ／ｚ如S}陆，

本文编号：2521379