不同功能肽修饰的聚乙烯亚胺衍生物作为基因载体的研究

发布时间：2019-08-02 19:00

【摘要】：基因治疗的本质是用基因载体携带目的基因进入靶细胞,通过遗传学或分子生物学技术以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病,从而达到治疗各种疾病的目的。基因治疗作为一种新的治疗手段,可以治疗包括癌症、心血管疾病和遗传性疾病等多种疾病,目前的研究主要集中于肿瘤的治疗。寻找安全高效的基因载体是基因治疗的关键之一。基因载体分为病毒型基因载体和非病毒型基因载体两大类。非病毒载体通过理化方法介导基因转移,具有无传染性、化学结构可控、不限制载体容量及容易于大量制备等特点。与病毒载体相比,它还具有低毒性、低免疫性、所携带的目的基因不会整合至宿主细胞基因组等优势。因此,非病毒载体领域近年来被广泛研究。聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)因其“质子海绵作用”而成为研究最广泛的一种聚阳离子非病毒基因载体。然而PEI在应用中存在三个突出问题:第一,聚合物的转染效率与细胞毒性不一致:即高分子量PEI转染效率高,细胞毒性大;而细胞毒性小的低分子量PEI,转染效率低。第二,体液稳定性与穿膜能力不一致:为了增加PEI体液稳定性而增加聚合物的亲水性,会导致PEI的穿膜能力降低,从而不利于目的基因的递送。第三,PEI的细胞靶向性差:PEI通过静电相互作用与细胞结合,因此无法识别特定细胞,靶向性欠缺。普朗尼克(Pluronic)是聚氧乙烯—聚氧丙烯—聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)组成的三嵌段共聚物。具有无毒、无刺激、无免疫原性、可溶于体液等优点,是制备聚合物胶束的常用材料之一。普朗尼克内部的PEO链与PPO链的比例可调,随着PEO链比例增高,该化合物疏水性越弱,反之,则疏水性越强。普朗尼克在水溶液中自发形成多分子胶束,所形成的胶束尺寸和病毒相仿,适合在体内传输。整合素是细胞表面受体的主要家族,是一种介导细胞和其外环境之间的跨膜受体。整合素是由α和β两个亚单位形成的异二聚体,由它们相互组合形成的整合素有20余种。其中,整合素αvβ3高效表达在多种肿瘤细胞表面和肿瘤新生血管的内皮细胞中,而在普通细胞中罕有表达,因此,整合素αvβ3已成为抗肿瘤药物的靶点。RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽链,能以一定的亲和力结合整合素αvβ3,为肿瘤治疗的靶向性提供了新的策略。细胞穿膜肽可以在不损坏细胞膜的情况下穿过细胞膜进入细胞质甚至细胞核。同时,它还可以介导DNA、多胺类物质进入细胞内。TAT(transactivator,Tat)是编码HIV复制和基因表达所必须的反式激活蛋白,是常见的三种细胞穿膜肽之一。TAT中49-57位氨基酸残基arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg(RKKRRQRRR)组成的线性序列可以完全行使细胞穿膜功能,这是TAT肽既有穿膜特性又无细胞毒性的最小片段。大分子物质通过核孔复合物在细胞浆和细胞核之间转运是一个主动耗能的过程,直径小于9 nm的分子或分子量小于60k Da的蛋白质可被动弥散通过核孔复合物中间通道。非病毒载体转染的质粒DNA,从细胞质向细胞核被动转运时效率较低,是一个限速过程。核定位信号肽NLS富含碱基,结合DNA形成的DNA-NLS复合物,在细胞质中可被转运蛋白识别,与蛋白质结合后将DNA转运入核。这一特点对复合物克服细胞核膜屏障、提高体内转染效率至关重要。拟设计三种多肽:(1)特异性亲和整合素αvβ3的RGD(R4);(2)特异性亲和整合素αvβ3的RGD肽与核定位信号肽NLS连接形成的双功能肽RGD-NLS(R11);(3)特异性亲和整合素αvβ3的RGD肽与细胞穿膜肽TAT、核定位信号肽NLS连接形成的三功能肽RGD-TAT-NLS(R18)。通过与PEI衍生物的连接,考察其作为基因载体修饰物对基因转染的贡献。其中,多肽可通过半胱氨酸(Cys)的巯基与PEI的氨基以SMCC为交联剂连接,因此多肽设计时应含有半胱氨酸(Cys)。三种功能肽在复合物入胞过程中起着不同的作用,将这三种肽以RGD为基础组合成三种不同的多肽,分别与聚乙烯亚胺衍生物偶联,形成三种不同的基因载体。通过比较其理化性质和细胞转染效果,来评价三种不同多肽在基因载体应用中的作用。我们对普朗尼克P123进行活化,以其交联低分子量PEI(PEI2KDa),得到高分子量聚乙烯亚胺衍生物P123-PEI。同时分别合成三种多肽R4、R11、R18,将三种多肽分别与PEI衍生物P123-PEI连接,形成三种新型转基因载体P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18。同时,比较包括细胞毒性在内的聚合物理化性质和细胞转染结果,评价三种不同多肽在基因载体应用中的作用。本文第一章主要介绍了聚乙烯亚胺PEI、普朗尼克及功能肽在基因载体中的应用。包括聚乙烯亚胺的特性、普朗尼克P123作为基因载体修饰材料的优势以及各种功能肽在基因载体应用中的研究成果等。本文第二章为三种基因载体P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18的合成和表征。采用固相法制取功能肽,用质谱测定多肽序列,HPLC测定相对含量。三光气和琥珀酰亚胺法活化P123后与PEI 2000连接形成P123-PEI高分子量的聚合物。最后通过SMCC分别将R4、R11、R18与P123-PEI偶联得到最终产物P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18,用1H-NMR表征聚合物的结构。结果表明,成功合成了功能肽R4、R11、R18,其纯度都在95%以上。通过1H-NMR分析,用SMCC法成功的将R4、R11、R18分别与P123-PEI偶联形成最终产物P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18。本文第三章考察了三种聚合物P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18的理化性质。将三种聚合物分别与DNA混合后静置,通过静电吸附作用形成一定质量比的复合物。通过酸碱滴定的方式考察三种复合物的缓冲能力,使用粒度—电位仪测定复合物的粒径及Zeta电位,采用扫描电镜观察复合物的表面结构,通过凝胶电泳考察各复合物包裹DNA的能力及其对DNA的保护能力,最后采用MTT法考察三种聚合物的细胞毒性。结果表明,三种聚合物的缓冲能力均明显好于纯水;复合物呈类球形结构,粒径和电位适中;P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18与DNA质量比分别为3.0、0.4和2.0时可以将DNA完全包裹,此外,三种聚合物都可以保护DNA抵抗较高浓度的Dnase I及血清的解离。与高分子量PEI(PEI 25 KDa)相比,P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18的细胞活性显著提高。本文第四章考察了三种复合物P123-PEI-R4/DNA、P123-PEI-R11/DNA、P123-PEI-R18/DNA的细胞转染能力。分别以绿色荧光蛋白质粒(p EGFP-N2)和虫荧光素酶质粒(p GL3-Control)为报告基因,考察三种复合物在B16细胞中的转染情况。分别通过荧光倒置显微镜和生物化学发光仪来评价绿色荧光蛋白质粒和荧光素酶报告基因质粒的表达情况。结果表明,三种复合物的转染效率都明显高于不连接多肽的聚合物P123-PEI。通过三种新合成的聚合物与先前课题组成功合成的基因载体P123-PEI-R13相互比较,得出聚合物P123-PEI-R11的转染效果是最好的;修饰基因载体的多肽种类不宜过多,过多反而影响细胞转染效率;在修饰的多肽种类适宜的情况下,核信号定位肽NLS能显著提高入核的效率。本课题合成了三种的新型的基因载体P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18,并通过综合比较得出它们都具有低毒性、高转染率的特性,适宜作为基因载体的备选材料。尤其是聚合物P123-PEI-R11,在各个方面性能评价都很突出,尤其是转染效率明显高于其他聚合物数十倍,最适合作为基因载体。在修饰的多肽种类适宜的情况下,核信号定位肽NLS是提高细胞转染效率的关键。
【图文】：

图 2-2. R4 的质谱图Fig.2-2 Mass spectrometry of R425'.401'8.626'120180240300360420480540mV

不同功能肽修饰的聚乙烯亚胺衍生物作为基因载体的研究

R11的质谱图
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R450;O632.63

【参考文献】