微粒（MPs）定量检测方法、条件的建立及其免疫学功能的实验研究

发布时间：2019-10-11 08:30

【摘要】：目的:微粒(MPs)作为细胞释放的一种“亚细胞结构”已经在自身免疫等多种疾病中被发现。已有研究表明MPs可打破免疫耐受,触发自身免疫应答。本研究旨在通过对MPs分析前影响因素的研究,建立一种MPs定量检测的优化平台,同时针对血浆和细胞培养上清液中MPs的研究,探讨其免疫刺激作用的发挥。方法:1.MPs定量检测方法及影响因素的分析(1)选取苏州大学附属第二医院住院SLE、RA及年龄和性别相匹配健康对照者(HC)各20例;(2)采用流式细胞术(FCM)和Bradford蛋白定量两种方法分别检测20例SLE患者血浆中总MPs的含量,并对比分析这两种检测方法的相关性;(3)流式细胞仪计数不同抗凝剂[枸橼酸盐,乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2),肝素]和无抗凝剂血浆中总MPs的含量;(4)流式细胞仪计数不同标本洗涤方式[洗涤贫血小板血浆(洗涤PPP)和直接贫血小板血浆(直接PPP)]下血浆中总MPs的含量;(5)流式细胞仪计数不同保存温度(4,-20,-80℃)和时间(1,3,7,10,14d)条件下血浆中总MPs的含量。2.MPs体外免疫学功能的检测(1)血浆中MPs的免疫学功能a.选取苏州大学附属第二医院住院及门诊SLE患者28例、RA患者29例及年龄和性别相匹配HC 40例;b.流式细胞术分别检测SLE、RA及HC血浆中总MPs、LDMPs和MDMPs的含量;c.选取SLE、RA及HC患者各三例,将新鲜EDTA-K2抗凝血浆经过离心洗涤制成含有MPs的洗涤贫血小板血浆(洗涤PPP),然后体外与PBMC共孵育48h,CBA检测细胞培养上清液中细胞因子的分泌情况。(2)细胞培养上清液中MPs的免疫学功能a.采用LPS、CAM及STS刺激THP-1细胞活化或凋亡;采用PMA+PHA、CAM及STS刺激Jurkat细胞活化或凋亡,同时流式细胞仪计数这两种细胞株刺激前及刺激后细胞培养上清液中MPs的释放情况;b.将凋亡THP-1细胞来源的单核细胞微粒(MDMPs)按照低、中和高浓度(10,20和40μg/m L)分别与Jurkat和PBMC细胞体外共培养14h,流式细胞仪检测T细胞表面中晚期活化分子CD71的表达情况;c.将凋亡THP-1细胞来源的单核细胞微粒(MDMPs)按照低、中和高浓度(10,20和40μg/m L)分别与Jurkat和PBMC细胞体外共培养48h,CBA检测细胞培养上清液中细胞因子的分泌情况。结果:1.MPs定量检测方法及影响因素的分析(1)流式细胞术法和Bradford蛋白定量法检测血浆中总MPs含量之间存在较高的相关性(r=0.597,P0.01);(2)枸橼酸盐抗凝血浆中总MPs含量最多(F=25.04,P0.01),与EDTA-K2、肝素及无抗凝剂血浆中总MPs含量相比较,差异有统计学意义(均P0.05);(3)SLE、RA和HC三组血浆直接PPP中总MPs含量均高于洗涤PPP中总MPs含量(均P0.05);(4)与相同保存温度下保存0d即新鲜血浆中总MPs含量比较,4℃,-20℃和-80℃三个温度下分别保存1,3,7,10d血浆中总MPs含量逐渐下降(均P0.05);而三个温度下分别保存14d血浆中总MPs含量逐渐升高,与相同保存温度保存0d的新鲜血浆中总MPs含量比较无明显差异。分别对三个温度下相同保存时间血浆中总MPs含量两两比较结果显示,新鲜血浆标本于4℃,-20℃和-80℃条件下分别放置1,3,7,10和14d血浆中总MPs含量无明显差异(均P0.05)。2.MPs体外免疫学功能的检测(1)血浆中MPs的免疫学功能a.SLE、RA患者血浆中总MPs、LDMPs及MDMPs含量均高于HC(均P0.05);b.与健康对照者(HC)相比,SLE患者血浆中MPs能刺激PBMC分泌IL-6、TNF、IFN-γ(均P0.05),RA患者血浆中MPs能促进PBMC分泌IL-6(P0.05)。(2)细胞培养上清液中MPs的免疫学功能a.THP-1细胞组:与未加刺激的对照组相比,CAM和STS均能刺激THP-1细胞释放单核细胞微粒(MDMPs)(均P0.05),而LPS能诱导THP-1细胞释放MDMPs,但无明显差异(P0.05);Jurkat细胞组:与未加刺激剂的对照组相比,STS、CAM和PMA+PHA均能刺激Jurkat细胞释放淋巴细胞微粒(LDMPs)且差异有统计学意义(均P0.05);b.与阴性对照组相比,20μg/m L和40μg/m L MDMPs均能诱导Jurkat细胞表面CD71分子表达水平增加(均P0.05),且随MDMPs浓度的增加而表达水平增高;(10,20和40μg/m L)MDMPs均能刺激PBMC细胞表面CD71分子表达水平增加(均P0.05),且随MDMPs浓度的增加而表达率升高;c.与阴性对照组相比,(10,20和40μg/m L)MDMPs均能刺激PBMC IL-10的分泌(均P0.05),同时40μg/m L MDMPs还能促进PBMC IFN-γ的分泌(P0.01),此外,不同浓度MDMPs还能诱导PBMC大量分泌IL-6,但无统计学差异(P0.05);20μg/m L和40μg/m L MDMPs能诱导Jurkat细胞IL-6的分泌(均P0.05),而10μg/m L MDMPs无此现象。结论:(1)血浆中MPs含量的检测应优先选用新鲜EDTA-K2抗凝血浆且不可多次离心洗涤,而且新鲜血浆标本在4℃,-20℃和-80℃条件下保存2周内对血浆中总MPs含量的检测无影响;(2)凋亡THP-1细胞培养上清液来源的MDMPs可活化刺激T细胞表面中晚期活化分子CD71的表达;(3)血浆中MPs和凋亡THP-1细胞培养上清液来源的MPs均可刺激T细胞分泌IL-6、IL-10、TNF及IFN-γ等Th1/Th2型细胞因子。
【图文】：

图 1-1 前向散射(FSC)及侧向散射(SSC) MPs“门”的设定Fig. 1-1 Establishment of MPs -gate by size in a forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) plot注:A, 过滤 PBS 作为空白对照, 排除背景噪音干扰, 作为 MPs 门的检测下限; B, 1μm 标准微球位置, 作为 MPs 门的检测上限; C, MPs 的位置即为<1μm(Note: A, Buffer noise was left out by the MPs-gate; B, 1μm calibration beads was set as theupper limit for MPs detection; C, MPs-gate size was setted <1μm)3.2 流式细胞术法和 Bradford 蛋白定量法检测血浆中总 MPs 含量的对比分析以 BSA（牛血清白蛋白）为标准品绘制了 Bradford 蛋白定量法标准曲线，其曲线方程为 y=602.9x+5.243，r2=0.999。为了对比分析流式细胞术和 Bradford 蛋白定量法对血浆中总 MPs 含量的检测是否有相关性，同时为了避免血浆中蛋白成分对Bradford 蛋白定量法对血浆中总 MPs 含量检测的影响，我们选取 20 名 SLE 患者新鲜EDTA-K2抗凝血浆。经过离心洗涤制成含有 MPs 的洗涤 PPP，采用上述两种方法进行检测，结果显示流式细胞术法[（6681±474）个/μL]和 Bradford 蛋白定量法（[2.69±0.17）μg/μL]对血浆总 MPs 含量的检测之间存在较高相关性（r=0.597，P<0.01），

第一部分 微粒（MPs）定量检测方法、条件的建立及其免疫学功能的实验研究3.3 不同抗凝剂来源的血浆中总 MPs 含量的检测结果针对 6 名健康人不同抗凝剂来源血浆样本中总 MPs 含量进行检测，流式细胞术检测结果显示，，枸橼酸盐、EDTA-K2、肝素抗凝剂和无抗凝剂血浆中总 MPs 含量分别为[（3657±353）个/μL、（3107±238）个/μL、（1978±176）个/μL 和（1176±106）个/μL]，四组间比较差异有统计学意义（F=25.04，P<0.01）。与枸橼酸盐抗凝血浆中总 MPs 含量比较，EDTA-K2、肝素及无抗凝剂血浆中总 MPs 含量少且差异有统计学意义（均 P<0.05）；其中无抗凝剂血浆中总 MPs 含量最少，与 EDTA-K2和肝素抗凝血浆中总 MPs 含量相比较有显著性差异（均 P<0.01）。如图 1-3 所示。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.6

【参考文献】

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1 马文新,崔巍,侯百东,林其燧;采用流式细胞术检测血小板微粒及其临床应用的初探[J];基础医学与临床;2000年05期

2 周婷君;马江敏;张世玉;莫雪垠;范媛;;T淋巴细胞表面活化分子表达及其活化相关影响因子[J];口腔生物医学;2014年02期

本文编号：2547393