VZV糖蛋白E基因胞外域的原核表达及其兔抗血清的制备

发布时间：2020-03-10 09:01

【摘要】：目的采用原核表达系统表达水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(g E)基因的胞外域,将纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔,制备该蛋白特异性抗血清。方法构建原核表达质粒g E-p ET-32a(+),测序后将其转化至E.coli BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,获得VZV g E融合蛋白。采用SDS-PAGE电泳、Western blot法鉴定其特异性,利用Ni2+-NTA柱对g E蛋白进行纯化,复性后免疫新西兰家兔,获得兔抗VZV g E血清;采用间接免疫荧光、Western blot法和ELISA法检测该血清的特异性和效价。结果成功诱导表达出VZV g E融合蛋白,SDS-PAGE鉴定提示其主要为包涵体表达,浓度约为3.01 mg/ml。蛋白经Ni2+-NTA柱纯化后,纯度约为90%。Western blot法显示,经变性、复性后的该融合蛋白有良好的免疫反应性。用该蛋白免疫新西兰家兔后获得兔抗VZV g E血清。ELISA分析显示,该兔抗血清的效价为1∶6 400。结论成功构建了高效表达VZV g E蛋白的原核表达系统,获得较高纯度的g E蛋白,可以作为VZV亚单位疫苗的候选抗原,制备了特异性及效价均较高的兔抗VZV g E多克隆抗体,为VZV感染的临床诊断及治疗提供了重要的实验工具。
【图文】：

量一致，表明融合蛋白主要以包涵体形式存在。见图2A。图1VZVgE基因胞外域PCＲ扩增和gE-pET-32a(+)酶切鉴定A:VZVgE基因胞外域PCＲ扩增图;B:重组质粒单、双酶切鉴定图;M:Marker;1:目的基因片段;2:阴性对照;3:重组质粒;4:重组质粒经XholI酶切;5:重组质粒经HandⅢ酶切;6:重组质粒经双酶切2．3VZVgE融合蛋白的复性、纯化及鉴定取纯化后的融合蛋白进行SDS-PAGE鉴定，软件分析显示，其纯度约为90%，见图2B。Lowry法测定融合蛋白的浓度为3．01mg/ml。应用鼠抗VZVgE单克隆抗体进行Westernblot鉴定，结果可见约73ku的特异性目的条带。见图2C。图2VZVgE融合蛋白经SDS-PAGE和Westernblot特异性鉴定A:融合蛋白的可溶性SDS-PAGE鉴定图;B:纯化后的融合蛋白SDS-PAGE鉴定图;C:融合蛋白的Westernblot分析;M:Marker;1:重组菌体破碎前总蛋白;2:重组菌体破碎后上清液;3:重组菌体破碎后包涵体;4:pET-32空载体对照;5:纯化前gE融合蛋白;6:纯化后gE融合蛋白;7:纯化前gE融合蛋白;8:纯化后gE融合蛋白;9:pET-32空载体对照;10:BL21空菌对照2．4兔抗VZVgE多克隆抗体ELISA法效价检测结果采用ELISA法检测，结果显示，免疫前兔阴性血清OD值为(0.253±0.037)，当免疫后血清最大稀释度达1∶6400时，其OD值为0.382＞s藊+3S，采用配对t检验分析，与免疫前兔阴性血清组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)，即多克隆抗体效价为1∶6400。见图3。2．5兔抗VZVgE多克隆抗体特异性鉴定采用间接免疫荧光法和Westernblot分析兔抗VZVgE多克隆抗体的特异性。结果显示，gE蛋白免疫血清仅在感染VZV的HF细胞上呈现典型的绿色荧光，在其他疱疹病毒感染的细胞中都不出现荧光。见图图3ELISA法分析兔血清中VZVgE抗体效价1:血清1∶200稀释度;2:血清1∶400稀释度;3:血清1∶800稀释

白主要以包涵体形式存在。见图2A。图1VZVgE基因胞外域PCＲ扩增和gE-pET-32a(+)酶切鉴定A:VZVgE基因胞外域PCＲ扩增图;B:重组质粒单、双酶切鉴定图;M:Marker;1:目的基因片段;2:阴性对照;3:重组质粒;4:重组质粒经XholI酶切;5:重组质粒经HandⅢ酶切;6:重组质粒经双酶切2．3VZVgE融合蛋白的复性、纯化及鉴定取纯化后的融合蛋白进行SDS-PAGE鉴定，软件分析显示，，其纯度约为90%，见图2B。Lowry法测定融合蛋白的浓度为3．01mg/ml。应用鼠抗VZVgE单克隆抗体进行Westernblot鉴定，结果可见约73ku的特异性目的条带。见图2C。图2VZVgE融合蛋白经SDS-PAGE和Westernblot特异性鉴定A:融合蛋白的可溶性SDS-PAGE鉴定图;B:纯化后的融合蛋白SDS-PAGE鉴定图;C:融合蛋白的Westernblot分析;M:Marker;1:重组菌体破碎前总蛋白;2:重组菌体破碎后上清液;3:重组菌体破碎后包涵体;4:pET-32空载体对照;5:纯化前gE融合蛋白;6:纯化后gE融合蛋白;7:纯化前gE融合蛋白;8:纯化后gE融合蛋白;9:pET-32空载体对照;10:BL21空菌对照2．4兔抗VZVgE多克隆抗体ELISA法效价检测结果采用ELISA法检测，结果显示，免疫前兔阴性血清OD值为(0.253±0.037)，当免疫后血清最大稀释度达1∶6400时，其OD值为0.382＞s藊+3S，采用配对t检验分析，与免疫前兔阴性血清组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)，即多克隆抗体效价为1∶6400。见图3。2．5兔抗VZVgE多克隆抗体特异性鉴定采用间接免疫荧光法和Westernblot分析兔抗VZVgE多克隆抗体的特异性。结果显示，gE蛋白免疫血清仅在感染VZV的HF细胞上呈现典型的绿色荧光，在其他疱疹病毒感染的细胞中都不出现荧光。见图图3ELISA法分析兔血清中VZVgE抗体效价1:血清1∶200稀释度;2:血清1∶400稀释度;3:血清1∶800稀释度;4:血清1∶1600稀

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