可注射微冰胶装载干细胞修复犬退变椎间盘的实验研究及颈椎间盘定量T2弛豫时间核磁观察

发布时间：2020-10-17 12:43

　　 背景据报道全世界有超过85%的成年人经受过颈腰痛的痛苦。因颈腰疼痛到医院就诊的病人数位居第2位,仅次于上呼吸道感染,尤其对于儿童和青年人颈椎椎间盘源性疼痛而言,虽然发病率罕见,但由于生活方式的改变,社会心理因素(如环境或情感等)均与之有较大的关系。此疾病不单给患者造成了很大的疾苦,也造成巨额的医疗成本损失。研究认为引起颈腰疼痛的主要病因是由于椎间盘退变所引起,生活节奏快和工作压力大的现代生活方式使得椎间盘退变的发病年龄逐渐趋于年轻化,因此对该疾病的研究引起国内外临床医生和科研工作者的广泛重视。在椎间盘退变早中期阶段一般采用缓解疼痛的姑息性理化疗法；晚期阶段则以有创性手术治疗为主。但目前的医疗技术尚未找到一种治愈椎间盘退变的方法。自1987年Friedenstein等发现间充质干细胞以来,其在再生医学领域的应用得到飞速发展。间充质干细胞来源广泛,具有很强的增殖和多向分化潜能,目前已广泛应用于多种疾病的免疫和再生治疗的应用研究。相应地,干细胞再生医学的发展也为椎间盘治疗带来了新的希望。研究者将具有多向分化潜能的间充质干细胞通过注射器注入到实验动物退变的髓核内,可再生修复髓核组织。但是由于髓核组织内压力过大,注射的干细胞悬液容易通过注射针孔发生返流而产生其他副作用,诸如形成骨赘等引起额外的疼痛。再者,退变的髓核组织内环境相当恶劣,注入的干细胞可能大部分无法耐受而走向凋亡或死亡。生物医学工程的发展为干细胞再生治疗椎间盘退变提出了新的策略,组织相容性生物材料可以包裹干细胞以提供保护和微环境支持,且水凝胶等材料可以为细胞提供类似在体的三维环境。一些温敏性水凝胶的体内原位成胶性能,使其成为良好的可注射的组织工程材料,因此可用于微创修复椎间盘退变。然而已有报道表明,水凝胶的机械性能较差,不能为高负载的椎间盘提供足够的力学支持。再者,温敏性水凝胶在未成胶前的细胞混悬液仍然可能被较高的髓核内压挤出针孔外。椎间盘退变与下腰痛有关已被广泛证实,人体椎间盘内细胞外基质具有高特异性的特点,其对物理化学微环境要求较高,椎间盘内细胞数量少,并且生化代谢缓慢,此微小环境还不能够被目前的细胞培养技术或动物模型所模拟反映。器官培养模型技术的发展具有很好的潜力,通过组织内三微环境相互作用,精确力学载荷和化学干预可反映人体间盘内的微环境。椎间盘器官培养技术发展较快,从先前比较单一的溶剂培养到后来的计算机精确控制干预,到采用多腔室、多轴系统维持间盘结构完整性、控制组织营养供应,模拟椎间盘生理条件或实施力学加载破坏间盘组织等。通过一系列施加条件阻止细胞外基质膨胀及增加营养传输,成熟的器官培养实验能够解决一些关键科学问题。由于犬椎间盘具有高度重复性、一致性、相似的成分比例和代谢速率特点,这种动物椎间盘模型能够为治疗药物筛选的研发,寻求退变病理过程中的力学机制转变和生理生化反应机理研究。因此,这种模型可初步用于探索抑制椎间盘内分解代谢和促进合成代谢的治疗机制。清华大学合作课题组前期研究工作发明了一种新型可注射微冰胶,这种微型冰胶以生物相容性材料聚乙二醇丙烯酸(Poly (ethylene glycol), PEG)为原材料,加入一定浓度化学交联剂低温缓慢成胶,冷冻干燥冰晶而获得多孔隙结构。PEG微冰胶大小和形状可控,伸缩性能良好,体内可降解。此种微冰胶与水凝胶干细胞细胞混悬液结合,为干细胞提供了不被体内退变微环境损伤的三维支持；同时,可以实现非温敏性水凝胶的注射治疗方式；还可以增强水凝胶的机械性能,形象地讲,微冰胶为水凝胶提供了骨架支持。同时,微冰胶良好的弹性使其可以通过临床微量注射器针头(27G)实现注射治疗,且形态立即恢复,不会被挤出针孔外,并且细胞极少发生死亡。经过定向诱导能够高效促进(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)向髓核样细胞分化。从这些特征看来,微冰胶是潜在的治疗椎间盘退变的细胞载体系统。因此我们认为本研究的意义在于,一种新型可注射和可降解的细胞载体和传输系统有望提高椎间盘退变的再生治疗效果。首先,微冰胶可为MSCs提供保护及三维支持,辅助干细胞治疗可发挥再生修复的作用；再者,可注射微冰胶系统实现了治疗的微创性；其次,微冰胶良好膨胀收缩性能使其注射后不会从针孔挤出,最大程度的保留了细胞和减少了因细胞溢出而产生的副作用；第四,微冰胶良好的机械性能可为脊柱提供一定程度的力学支撑；最后,微冰胶生物相容性好,不会产生毒副作用。椎间盘退变的早期发现主要依赖于核磁影像学(Magnectic Reasonance Imaging, MRI)的检测,生物学治疗的检测结果一直采用传统MRI进行随访观察。Pfirrmann分级是评估椎间盘退行性病变的经典检测手段,但由于Pfirrmann分级是一种半定量检测方法,因此需要一种更为早期、敏感的影像学检测技术来更为准确的评估退变程度或治疗效果。传统的组织学技术是检验椎间盘退变的金标准,但由于有创操作无法在临床中实施。T2弛豫时间值(T2 relaxation times)是应用T2图(T2 mapping)进行量化测定的指标,可以通过描述氢质子系统(组织)横向驰豫衰减来量化反映组织水分子状态的变化,通过衡量不同回波时间的MRI信号强度计算得出值。T2弛豫时间成像是MRI研究组织水分子状态的一项新技术,国内外已有报道椎间盘内髓核的T2值与胶原的排列方向、胶原、蛋白及水的含量相关,能够定量地反映髓核内生化成分的改变,因此通过定量T2弛豫时间成像技术能够反映早期椎间盘内生化的改变,为早期椎间盘的生化改变及鉴定提供一种新的方法。综上所述,首先,本研究拟将PEG制备的微冰胶材料,通过体外器官长期培养观察其对脂肪来源间充质干细胞(Adipose-Derived Stem Cells, ADSCs)的存留情况及对犬退行性椎间盘退行性病变的修复研究,期望这种新型可注射微冰胶材料不仅可以为ADSCs提供三维培养环境,而且还具有防止注射细胞渗漏,延长其作用时间,提高干细胞的生物学活性及修复椎间盘退变功能。其次,本研究首先通过测量青年人颈椎间盘MRI T2弛豫时间值,量化分析颈椎间盘早期含水量、大分子蛋白多糖和胶原纤维成分等的生化状态变化与传统Pfirrmann半定量分级之间的关系,探究T2弛豫时间成像技术在早期颈椎间盘退行性病变中应用的可行性,为MRI对椎间盘退行性改变的客观评价提供量化标准。目的1、应用PEG微冰胶(Microcryogels, MGs)装载包裹MSCs的海藻酸钠水凝胶(PEG-Microcryogels, PMs),体外器官培养观察PMs支架材料对ADSCs的存留观察及微环境对MSCs的影响；2、体内观察利用PMs支架材料装载ADSCs长期修复退变椎间盘的可行性。3、通过测量青年志愿者颈椎间盘髓核MRI T2弛豫时间值,探讨T2弛豫时间成像技术在早期颈椎间盘退变中应用的可行性。方法1、PMs微冰胶制备：用计算机辅助系统制图软件制作微孔阵列图形,以聚甲基丙烯酸酯(Polymethyl methacrylate, PMMA)薄板为原料,在激光雕刻机上制作微孔模具板,长75cm,宽25cm,厚300μm,约600个孔每板；为增加模具板亲水性,等离子处理2min;10%质量/体积(Weighte/volum, w/v) PEGDA与0.2%w/v四甲基乙二胺(Tetramethylethylenediamine, TEMED)和0.5% w/v过硫酸铵(Ammonium Persulfate, APS)配成微冰胶预备液；用刮片的方法使微冰胶预备液进入每一个微孔,置于零下20度成胶；真空冷冻干燥形成多空联通结构(-45℃,30min)；微冰胶浸泡于双蒸水中可以即可从模具板上脱出,收集到70μm漏网,用蒸馏水清洗后滤除多余水分；将微冰胶置于小皿中铺成薄层,二次冷冻备用。使用之前,冷冻干燥后紫外线(Ultraviolet, UV)灭菌或环氧乙烷灭菌后即可装载细胞。2、选用4个含有两段完整的椎骨及椎间盘的运动节段(T12-L1, L2-L3, L4-L5, L6-L7)的椎间盘组织,利用10ml注射器和21G针头从纤维环(Annulus Fibrosus, AF)扎入,抽取髓核(Nucleus Pulposus, NP)组织(约25mmg)。吸取40μl1×105 Luc-GFP的MSCs悬液,另一组为40μl负载相同数量MSCs的PMs重悬于0.5%透明质酸溶液,均由21G针头注射入髓核进行对比,于器官营养液中培养一月后,每5天观察生物荧光图像,评估细胞在NP中的停留,第30天福尔马林液固定椎间盘并用于组织学染色分析。3、选用15只比格犬作为实验动物,用髓核抽吸法建立犬椎间盘退变模型(L3-4/L4-5/L5-6/L6-7),动物实施造模术后4周行腰椎正侧位X线和MRI检查建立犬椎间盘退行性病变椎间盘模型,证实退变模型造模成功后,对剩余12只动物模型行ADSCs移植手术。每只犬的椎间盘被分为4组：退变组(Sham,L3-4),单纯干细胞注射组(MSCs, L4-5),单纯材料注射组(PMs,L5-6),材料装载干细胞移植组(PMs+MSCs,L6-7),其中L7-S1作为阴性对照组,不做任何处理。细胞移植术后4、8、12和24周进行动物腰椎正侧位X线片及MRI检查,量化椎间盘相对高度指数及髓核相对灰度指数；组织学评分观察内层纤维环破坏程度,术后12、24周处死动物取材,对髓核组织进行冰冻切片,利用荧光显微镜观察冰冻切片绿色荧光蛋白表达情况；整体椎间盘及髓核组织普通切片,利用HE染色和番红O染色观察组织形态学变化,利用免疫组织化学染色观察各组椎间盘周围组织的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(ACAN)及移植组GFP的表达；并用EL1SA法检测细胞蛋白多糖、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原蛋白水平(PG,COL1和COL2)。4、对40例无任何症状的青年健康志愿者进行颈椎3.0 T MRI T2加权成像(T2 weighted image, T2 WI)和T2弛豫时间成像技术扫描。男19例,女21例,年龄18-25岁,平均年龄22.80±2.11岁,所有受试志愿者均无颈痛和颈椎部畸形/外伤/手术病史,C3-C7的T2WI和T2弛豫时间成像技术扫描均在GE Signa 3.0 T-HD-MRI扫描仪上实施,GE-ADW 4.3后处理工作站Functool软件对原始数据进行处理,生成T2伪彩图。在C3-C7髓核及前后纤维环内分别放置感兴趣区域(Region of Interest, ROIs),测量T2弛豫时间值。分别对每个颈椎间盘进行Pfirrmann (Ⅰ-Ⅴ)分级,分别评估性别之间、不同解剖部位之间的T2弛豫值,研究T2弛豫值与Pfirrmann退变级别之间的相关性。5、采用SPSS13.0软件进行统计学分析(SPSS Inc., Chicago, IL, USA),用双因素方差分析研究分组与时间的主效应和交互效应,两个重复测量因素的方差分析或Post Hoc进行多重平均值比较,Kappa检验评价观察者IVDD分级的一致性。采用Pearson相关分析分别评价椎间盘NP和AF前后缘T2值与年龄、分级与年龄的相关性。三因素方差分析研究性别、解剖部位及解剖节段之间的交互效应,误差限图及受试者操作特点用于数据分析,P值小于0.05为差异有统计学意义,数据采用平均值±标准差表示。结果1、椎间盘注射GFP染色细胞后立即通过生物发光活体成像仪观察,可以发现单纯细胞注射组明显的细胞渗漏,而PMs+MSCs注射组无渗漏现象,PMs+MSCs注射组能够显著存留细胞,细胞信号持续表达长达25天,而单纯MSCs注射组在15天后即无法观察到光子信号。大体观察和HE染色可观察到PMs+MSCs注射组能够显著维持椎间盘高度,而MSCs注射组明显观察到椎间盘高度减低。PMs+MSCs注射组中可以显著保留髓核组织。番红O染色显示了椎间盘中的糖胺聚糖和少量的髓核细胞,PMs支架结构仍然可以观察到。免疫组化染色显示PMs+MSCs注射组较强阳性表达ACAN和COL2。2、术后4周X线结果显示造模节段椎间盘相对高度指数与对照组对有无差异(P0.05),而MRI检查结果显示髓核相对灰度指数下降,与对照组相比有统计学差异(P0.05),与正常组比较,其他组椎间盘高度在观察时间内持续降低。然而与造模组比较,MSCs注射组和PMs注射组在8、12、24周能够显著提高DHI%(P0.05)。PMs+MSCs注射组的椎间盘降低程度与其他组相比有明显延缓(P0.05)。NC组的T2信号强度(Signal Intensity, SI)在观察时间内基本无任何变化,与NC对比后发现,其他所有组的平均SI在4周时明显减少(P0.05),而在8周时,PMs+MSCs注射组SI较其他治疗组高(P0.05),MSCs注射组和PMs+MSCs注射组之间SI无显著性统计学差异(P0.05),但与造模组对比具有显著性统计学差异(P0.05)。24w时收集6只犬标本行HE染色,结果显示造模组组织学评分为4-5,PMs+MSCs注射组评分为1-2分,而PMs注射组和MSCs注射组评分为1-3分。整个实验过程中,NC组评分一致(0分)。HE染色显示NC组椎间盘高度无任何狭窄,而单纯造模组则显示严重退变程度,表现为AF断裂及高度降低,其他治疗组则显示髓核中度退变,但椎间盘高度变化均有一定程度的延缓。PMs+MSCs注射组显示较为满意的高度维持。番红O染色显示MSCs注射组和PMs+MSCs注射组内细胞外基质GAG类似,在sham组和部分PMs注射组中显示髓核退变比较严重。然而,PMs注射组与MSCs注射组对椎间盘功能的维持效果类似。番红O染色显示治疗后12周PMs注射组和PMs+MSCs注射组可见疑似PM网络支架,在24周时,PM材料在所有切片中几乎看不见,而在这两组中可见疑似海藻酸钠材料。24周时可在MSCs注射组和PMs+MSCs注射组均可观察到少许GFP阳性MSCs。而在PMs+MSCs组内似乎可见到更多阳性表达。ELISA检测了各组髓核中SOX9、PG、COL2和COL1蛋白表达结果,与正常组对比,其他组软骨相关标记物均显著降低。然而,与sham组比较,PMs注射组和MSCs注射组的成软骨相关蛋白表达显著增高。与MSCs注射组比较,PMs+MSCs注射组内SOX9和COL1表达无显著性统计学差异(P0.05),而PG和COL2表达均显著增加(P0.05)。1月后在单纯MSCs注射组椎间盘周围组织中可以明显观察到纤维化组织,而PMs+MSCs注射组则较少阳性表达,在单纯MSCs组椎间盘注射周围组织中也可以观察到GPF-MSCs阳性染色表达。HE染色可以观察到单纯MSCs组椎间盘注射周围组织较多纤维化组织,而在PMs+MSCs组则纤维化组织较其他组均明显减少。COL2及PG染色显示单纯细胞注射组椎间盘注射周围组织有强阳性表达。3、无任何症状性青年人颈椎椎间盘的Pfirrmann分级主要为Ⅰ-Ⅱ级,但Ⅲ级发病率仍较高(36%)。所有解剖节段的髓核T2值均比同节段的AF值高(P0.000),在同一节段,男女之间的髓核、前、后纤维环值均无显著性统计学差异(P0.05)。髓核T2值与Pfirrmann值呈一致性降低。线性相关分析显示Pfirrmann分级与髓核的T2值呈强负相关(P=0.000),但与纤维环的T2值无明显相关性(P=0.854),然而,统计学分析显示非退行性改变的椎间盘(PfirrmannⅠ-Ⅱ级)T2值极值分布较大。ROC曲线分析显示Ⅰ级椎间盘的T2可信度界值为(62.03ms),Ⅱ级椎间盘的T2可信度界值为(54.60-62.03 ms),Ⅲ级椎间盘的T2可信度界值为(54.60 ms)。结论首先,体外器官培养模型显示PMs能够有效改善的细胞存留和存活状态。PMs微冰胶辅助ADSCs移植犬退行性病变椎间盘髓核后能够促进间充质干细胞长期存活,并且能够增加髓核内细胞外基质的含量及含水量,延缓椎间盘高度及亮度的降低,能够有效延缓椎间盘退变的进展。该研究结果证实了PMs微冰胶辅助间充质干细胞体内修复退变椎间盘的潜能,可注射PMs在细胞治疗椎间盘退变的方法中可能是一种十分有效的策略。其次,T2弛豫值为鉴别青年人早期椎间盘退变提供一种更加敏感及更有力的检测手段,并且为青年人颈椎间盘的早期诊断提供可信的量化区间。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R681.53;R445.2
【部分图文】：

值与脑脊液的灰度值比作为相对灰度指数Ｓ护３１。腰椎正侧位Ｘ线平片及ＭＲＩ的??测量均由Ｈ个观察员盲法进行测量，每幅图像重复测量３次，取其平均值，作为??测量结果（若测量误差较大，则数据舍去）（图１－２）。??图１－２椎间盘信号值的测量??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ｓｉｇｎａｌ?ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ?０?ｆ?ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ?ｄｉｓｃ??１丄８．２．３免疫组化染色和免疫巧光染色??①

利用慢病毒转染犬脂肪源ＭＳＣｓ，使细胞表达绿色巧光蚕白（如Ｐ）??用于动物体内实验，使细胞融合表达莖火虫英冠素酶（Ｌｕｃ）和ＧＦＰ用于体外器??官培养检测（图１－４Ａ）。单个犬运动节段的体外器官培养模型用于追踪注射后的??细胞。通过生物光活体成像观察注射到器官中的ＬＵＣ－ＧＦＰ＋阳性细胞，可Ｗ观察??到细胞存留及存活情况。ＭＳＣ转染病毒后用流式细胞术筛选阳性细胞，ＭＳＣｓ??可Ｗ高表达巧光素酶至少一个月Ｗ上。抽吸髓核后，利用２１Ｇ注射器针头将悬??浮在０．５％的透明质酸溶液中４０叫ＬＵＣ－ＧＦＰ＋?ＭＳＣｓ装载的ＰＭｓ?（ＰＭｓ?＋?ＭＳＣｓ注??射组）混合液注射到椎间盘中，单纯ＭＳＣｓ注射组作为对照组，如图４Ｂ所示，??将每两个运动节段培养在一个玻璃瓶中１月余。向椎间盘注射后立即通过生物??发光活体成像仪观察，均发现单纯ＭＳＣｓ注射组明显的细胞渗漏，而ＰＭｓ?＋?ＭＳＣｓ??注射组均无渗漏现象（图１－４Ｃ）。持续培养１月期间

??光素底物溶液中，记录与细胞反应产生的光子。如图１－４Ｅ和Ｆ，分组与培养时??间的交互效应对于ＰＭｓ＋ＭＳＣｓ均有盈著性统计学差异（Ｆ＝１７．２３１，Ｆ＝２４．４９２，??ＰＯ．ＯＯＯ）。而在５天、１０天、１５天的同一时间点，ＰＭｓ＋ＭＳＣｓ与ＭＳＣｓ组对比??均有显著性统计学差异（Ｐ＜０．０５），２０天和２５天两组对比均无显著性差异??（Ｐ＞０．０５），ＰＭｓ＋ＭＳＣｓ注射组能够显著存留细胞，细胞信号持续表达长达２５??天。但单纯ＭＳＣｓ注射组在１５天后即无法观察到光子信号，１个单纯ＭＳＣｓ注??射椎间盘组光子信号表达仅为１０天。??㈱壁芭’?ｉ：ｌｉＵｌｌ??Ｅ?ｃＭ?ｄ５?ｄ１０?ｄ１５?ｄ２０?ｄ巧?ＭＳＣｓ??只朽。ｎｎｆｉ．。］、?＊ｐｍｓ＋ｍｓｃｓ??Ｉ?起！！＊Ｍｓｃｓ??跑匪隱心??ＭＳＣｓ?ＰＭｓ?＋?ＭＳＣｓ??图１－４?ＰＭｓ辅助的细胞注姑在体外椎间盘器官培养模型中展现了良好的防细胞渗漏及改善??细胞存留的巧能??（Ａ）利用慢病毒转染法令犬脂肪来源ＭＳＣｓ表达ＧＦＰ?（上行）或Ｌｕｃ－ＧＦＰ?（下行），成像??系统为以１１１山１３１￥１５１１。（：８）体外器官培养系统示意图，８〇１１１１玻璃瓶，瓶口巧松。（０生??物冷光成像显示了细胞的直接注巧会导致严重渗漏

本文编号：2844795