癌胚抗原及甲胎蛋白与游离绒毛膜促性腺激素双标记磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂的研制

发布时间：2020-10-27 07:40

　　 标记免疫分析技术问世于60年代初期,由此开创了标记免疫分析的新纪元。标记免疫分析是将多种标记示踪技术的高度灵敏性和医学免疫学抗原抗体反应的高度特异性相结合的产物。经过近几十年的发展,标记免疫分析技术促使临床生化分析由常量分析提高到微量和超微量分析,现已广泛应用于疾病诊断、疗效观察和医学科学研究。在固相免疫测定中,待测分析物与载体固定的抗体形成反应复合物,而捕获抗原用的抗体通过与另外的捕获蛋白结合或者简单的疏水作用使其固定于载体表面。利用抗原抗体反应具有高特异性和高亲和性的特点,固相免疫测定提供了一种简单快速分离未结合反应物的方法,通过检测标记抗体的信号就可以测定出待测分析物的浓度。随着检测方法的革新和技术的进步,发展到目前,标记免疫分析法已包括放射免疫分析法(Radioimmunoassay, RIA)、荧光免疫分析法(Fluorescence immunoassay, FIA)、酶联免疫分析法(Enzyme linked immunosorbent assay, EIA)、化学发光免疫分析法(Chemiluminescence immunoassay, CLIA)、电化学发光免疫分析法(Electrochemiluminescent immunoassay, ECLIA)、时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)等。在这几种方法中,TRFIA是一种新型的超微量的标记免疫分析方法,具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、标记物稳定性好、无放射性污染、检测重复性高、不受样品的自然荧光干扰等优点而越来越受到人们的青睐,成为继放射免疫分析之后,标记免疫分析法发展的一个新的里程碑,并以其独特的优势在近些年迅速发展,已延伸至医学、生物学、环境科学和食品安全等各个领域。时间分辨荧光免疫分析技术通常采用具有独特荧光特性的镧系元素铕(Eu)、铽(Tb)、钐(sm)、和镝(Dy)及其螯合物作为示踪物,具有激发光谱带宽、发射光谱带窄、Stokes位移大、荧光衰变时间长、荧光强度高和标记物理化性质稳定等优越性。此外,利用上述镧系稀土离子的荧光衰减时间长及波长差异大的特点,可以利用多种标记的镧系元素离子的荧光进行多分析物同时检测。多元免疫分析方法拥有许多传统免疫分析无以伦比的优势,可一次性对具有联合检测意义的多个待测物进行筛选,与单一靶点作用的传统免疫分析筛选方法相比通量更高,具有省时省力省样品等优点,在临床免疫学检测方面显示出广阔的应用前景。在临床医学诊断中,为提高诊断敏感性、特异性,往往需要多种标志物联合检测：癌抗原125(CA125)和人附睾分泌蛋白-4(Human epididymis protein-4, HE4)相结合预测卵巢恶性肿瘤;甲状腺功能检测里面,甲状腺相关激素浓度变化跟不同的甲状腺功能障碍密切相关；血清C肽和胰岛素水平的同时检测对糖尿病的分型诊断具有很大帮助；血液筛查中需要对人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、梅毒螺旋体(Treponemiapallidum, TP)等多种传染病进行检测及乙肝五项、TORCH的孕前检查等等。由此可见,对多元时间分辨荧光免疫分析方法的研究具有很强的理论和现实意义。磁性纳米颗粒是纳米粒子的一种,是20世纪50年代研制出的一种新型功能材料。磁性纳米颗粒多由铁、钴和镍等过渡金属的氧化物所构成,在外加磁场力的作用下,磁性纳米颗粒能够快速地与底液相分离,具有操作简便、分离效率高、特殊的理化性质、较大的比表面积及良好的物理稳定性等优点,是一种性能优良的磁性分离载体。目前,将磁性纳米颗粒高效的分离和富集作用与免疫学反应的高度特异性相结合,成为了近年来发展起来的一项新的免疫学技术一免疫磁珠(Immunomagnetic beads,IMB),并在免疫检测、细胞分离和培养、生物大分子纯化和分子生物学等领域得到了越来越广泛的应用,同时已成为国内外的研究热点。目前,免疫磁珠结合酶免检测方法是其在免疫检测领域最主要的应用,该免疫磁珠-ELISA方法主要用于免疫检测,细胞和微生物的分离,蛋白质、DNA、RNA以及mRNA等生物大分子纯化检测,并且免疫磁珠结合荧光免疫分析或化学发光免疫分析法应用于食品安全和环境监测方面也有不少研究,但免疫磁珠结合时间分辨荧光免疫分析技术应用于临床疾病标志物分子检测的研究较少。癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen,CEA)是一种分子量约为200KD的多糖蛋白复合物,于1965年首先由加拿大学者从结肠腺瘤和胎儿肠中提取的一种肿瘤相关抗原。一般情况下,CEA是由胎儿胃肠道上皮组织、胰腺和肝的细胞所合成,通常在孕妇妊娠前6个月内CEA含量增高,生产后母体血清中含量极低,健康成年人血清中CEA浓度较低,故名为癌胚抗原。CEA属于非器官特异性肿瘤相关抗原,由内胚层细胞分化而来,在细胞质中形成,穿过细胞膜进入体液,故可在多种液体中检测出。癌胚抗原是一种广谱肿瘤标志物,在多种胃肠道恶性肿瘤患者的血清中CEA的含量明显升高,如直结肠癌、肝癌、胰腺癌等,其中直结肠癌阳性率最高。此外,在乳腺癌、肺癌及其它恶性肿瘤的血清中也有不同水平的升高。CEA作为一种最常见的肿瘤标记物,虽然不能作为特异性指标诊断某种恶性肿瘤,但是在用于各种恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤分期、监视病情和治疗以及预后判断等方面,具有重要的临床价值。唐氏综合征又称21-三体综合征或先天愚型,是发病率较高的染色体病。其主要特征是严重先天智力障碍,特殊面容,并常伴有各种先天畸形。产前筛查是通过采用经济、简便和无创伤的检测方法,从孕妇中筛查出怀有某种先天性缺陷儿(如21-三体综合征、神经管缺陷)的高危孕妇,最大限度的减少异常胎儿的出生,以达到优生优育的目的。目前这些病尚无有效的治疗手段,因此产前筛查和诊断21-三体综合征、神经管缺陷以降低其患病儿的出生率显得尤为重要。近年来许多研究学者发现孕妇血清中胎儿胎盘产生的甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)、游离绒毛膜促性腺激素(Free β-human chorionic gonadotrophin, Free β-hCG)、妊娠相关血清蛋白(Pregnancy-associated plasma protein-A, PAPP-A)和游离雌三醇(Unconjugated estriol, uE3)等含量异常与21-三体综合征、神经管缺陷密切相关,并将这些标记物应用于产前筛查。由于迄今为止发现的血清标志物在单独使用时,大都存在检出率低、假阳性、假阴性等缺陷,以期弥补上述缺陷,大多采用多项标志物的联合检测。Free β-hCG和PAPP-A是孕早期(8到14周)筛查先天缺陷儿的最佳组合,而孕中期(14～24周)采用母体血清AFP和Free β-hCG联合检测,结合年龄、孕周等因素进行唐氏综合征的产前筛查,检出率可达60%～80%。由于方法的简便易行且无创伤性,便于在孕妇中进行大规模的筛查,最大可能的避免这些缺陷胎儿的出生,提高出生人口的素质。尽管在TRFIA技术领域取得了很大的成功,但是仍然迫切需要不断地完善和改进现有的检测技术,建立更为简单、特异、灵敏的临床免疫分析检测方法以应对现代医学诊断和生物医学研究的快速发展和需求。本课题是在本实验室前期研究的基础上,旨在结合磁分离技术和TRFIA技术,通过将特异性抗体偶联在磁珠表面,即免疫磁珠,用免疫磁珠、镧系稀土元素螯合物标记抗体及样本中待测抗原在反应管中经过振荡孵育后形成免疫磁珠-抗原-镧系稀土元素螯合物标抗体复合物。加入增强液振荡反应后,在紫外光的激发下发射出强烈的荧光,通过时间分辨仪器测定其荧光强度。荧光强度与样品中的待测分析物浓度成正比,对照标准曲线即可确定样品中抗原含量。除拥有TRFIA技术的灵敏度高、储存时间长、无放射性污染、标准曲线范围宽等诸多优点外,还通过免疫磁珠的富集作用以及磁珠在液体中充分扩散使得结合表面积扩大,大大缩短反应时间,提高检测灵敏度。通常情况下,大部分免疫分析技术通过物理吸附的方法将抗原或者抗体包被在96微孔板上,用于捕获样本中的待测分析物。但由于空间位阻的原因,抗原抗体结合并不对称而且结合量有限,在检测高浓度样品时很容易形成HOOK效应。然而磁珠与抗体通过化学基团定向连接,能够使偶联的抗原或者抗体暴露出更多的活性结合位点,大大减少配对抗原或者抗体的用量以及提高检测的线性范围。该技术易实现自动化,并克服了传统微孔板式TRFIA技术需要样本累积到一定数量才能检测的缺点,实现了样本的即时检测。此外,以磁珠作为固相载体,可以分别包被针对不同检测项目的抗原或者抗体,再利用多种镧系稀土元素螯合物分别标记配对的抗原或者抗体,更容易实现多元分析。本研究主要是利用磁珠作为包被抗体的固相载体并结合时间分辨荧光免疫分析技术,采用双抗体夹心法研制出磁珠时间分辨检测CEA的单标记荧光免疫分析试剂和同时检测AFP及Free β-hCG的双标记荧光免疫分析试剂。本课题实验内容主要分为三大部分：1)、用不同粒径、不同化学基团修饰的磁珠连接抗体,选取合适的磁珠作为固相载体并且优化连接工艺和镧系稀土元素螯合物标记抗体；2)、反应体系的建立和优化,并通过优化的反应体系对试剂盒的各项性能指标作出全面而整体的分析,包括：准确性、灵敏度、特异性、精密度、抗干扰性分析、稳定性：3)、用自制试剂盒与国外同类的诊断试剂进行比较,评价其初步应用于临床检测的可行性。研究结果一显示,自制的CEA磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂在最优条件下,经测定本试剂分析灵敏度为0.5 ng/mL,将抗原稀释成不同浓度进行测定,测得标准曲线线性范围为1～1000 ng/mL。用本研发试剂对三个不同浓度自制的CEA质控品进行检测,结果本试剂的分析内变异系数(CV%)为2.722%～3.252%和分析间变异系数(CV%)为3.157%-3.765%。回收率实验结果为90.1%-99.2%,符合试剂盒要求。将高浓度的A FP、CA125、癌抗原19-9(CA19-9)及人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)当作样品用本试剂测定,结果表明无明显交叉反应。检测质控样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红索的干扰。试剂盒放置于37℃7天或4℃ 1年,各项性能指标均符合要求,稳定性较好。用自制的试剂分别与PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA试剂盒和雅培公司的化学发光试剂盒同时对239份血清样本进行检测。以自制试剂测定血样的CEA浓度结果为横坐标,以P erkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA测定的浓度结果为纵坐标做回归分析,相关方程为：Y=1.049X+1.696,相关系数R2=0.970,P0.001。以自制试剂测定血样的CEA浓度结果为横坐标,以雅培公司化学发光测定的CEA浓度结果为纵坐标做回归分析,相关方程为：Y=0.873X-3.802,相关系数R2=0.951,P0.001。经统计学处理结果表明,本方法同PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA和罗氏电化学发光试剂盒临床血样测值均具有显著相关性。研究结果二显示,自制的AFP及Free β-hCG双标记磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂在优化的条件下,经测定本试剂AFP分析灵敏度和标准曲线线性范围分别为0.05 ng/mL和0.1-750 ng/mL, Free β-HCG分析灵敏度和标准曲线线性范围分别为0.08 ng/mL和0.16～450 ng/mL。用本自制试剂对AFP及Free β-hCG质控品进行检测,结果AFP的分析内变异系数为2.6%～5.1%和分析间变异系数为1.9%～5.1%,Free-β-HCG的分析内变异系数为4.1%-4.7%和分析间变异系数为4.7%～5.0%。回收率实验96.0%-106.0%,符合试剂盒要求。将高浓度的CEA、CA125、CA15-3、CA19-9、LH、FSH、TSH及hCG当作样品用本试剂测定,结果表明无明显交叉反应。检测质控样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。试剂盒放置于37℃7天或4℃ 1年,各项性能指标均符合要求,稳定性较好。用自制的试剂和PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA试剂盒同时对444份孕中期血清样本进行检测。以自制试剂盒测定血样的浓度结果为横坐标,以PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA试剂盒测定的浓度结果为纵坐标做回归分析,AFP相关方程为：Y=0.961X+1.554,相关系数R2=0.970,P0.001;Free β-hCG相关方程为：Y=1.044X-1.421,相关系数R2=0.966,P0.001。经统计学处理结果表明,本发明方法同PerkinElmer Wallac公司微孔板式TRFIA试剂盒具有显著相关性。综上所述,本论文一方面初步阐明了本研究研制的CEA磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂、AFP及Free β-hCG双标记磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂的各项指标(准确性、灵敏度、精密度、特异性等)均满足临床检测试剂要求,临床评测结果与进口产品性能相近,有望通过优化后应用于生产,同时将进一步开发临床疾病标志物的试剂。另一方面初步阐明了利用磁珠作为固相载体应用于时间分辨荧光免疫分析能够提高检测灵敏度,扩大线性范围,缩短分析时间,提高检测效率等优点,有望进一步将其应用到多元分析中,在临床分子诊断和食品检测等生物化学分析中具有非常重要的意义。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R446.6
【部分图文】：

图３?ＤＥＬＦＩＡ时间分辨癸光免疲分析法原理图??Ｆｉｇ．３?Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ＤＥＬＦＩＡ?ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ?ｆｌｕｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ??根据各铜系离子的巧光波长及衰减时间差异很大的特点，可ｗ对多种标记??的铜系离子的英光同时进行测量Ｗ检测样品中的多种祀标，Ｗ实现多标记英光??免疫分析。在双重标记分析中，Ｅｕ３＋和Ｓｍ３＋是较为经典的一对铜系稀±离子，Ｅｕ３＋??和Ｔｂ３＋是另一对常用双标记分析的铜系离子Ｐｇｊ。上个世纪９０年代，Ｘｕ等开发出??的共用巧光增强液ＰＷ，用这种方法可Ｗ从新生儿少量的血样本中同时查出四个??有价值的相关疾病指标，充分显示了多标记分析的省时、省为和省试剂的特点，??在检测多种分子的筛查实验和一些珍贵样品的检测具有广阔的应用前景。??稀±元素作为金属离子，很难直接巧抗原抗体结合，因此在标记时需要有??一种双功能基团的藝合物，它们分子内或带氨基和袋基或带有异硫幫酸基，和??殘酸基，一端与稀±离子连接，一端与抗原或抗体的自由氨基连接。此外，关??

两步法比一步法增加了反应步骤，但优点是使免疫反应更充信号值有所提高，抑制效应（Ｈｏｏｋ）出现较晩。??表１－３最佳反应模式??Ｔａｂ．?１?－３?Ｏｐｔｉｍａｌ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｍｏｄｅ??反应模式?一步法巧光值?两步法巧光值??Ａ?９６１?１１３０??Ｂ?４５０６?４７２３??称准品?Ｃ?１６７７６?１９７６４??Ｄ?３５１２４?３９１２１??Ｅ?４５１３１３?４７５７１８??Ｆ?２１６４５８０?２２１３５９８??

Ｗ?Ｐｅｒｋｉ证Ｉｍｅｒ?Ｗａｌｌａｃ公司微孔板式ＴＲＦＩＡ测定的浓度结果为纵坐标做回归分??析（Ｏｒｉｇｉｎ?Ｐｒｏ７．５?Ｍｉｃｒｏｃａｌ，ＵＳＡ），相关方程为：Ｙ＝?１．０４９Ｘ＋１．６９６，?（ｒ２＝０．９７０，??Ｐ＜０．００１），见图１－９Ａ。Ｗ自制试剂盒测定血样的ＣＥＡ浓度结果为横坐标，Ｗ雅培公??司化学发光测定的ＣＥＡ浓度结果为纵坐标做回归分析，相关方程为：Ｙ＝??０．８７３Ｘ－３．８０２
【参考文献】

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1 林文涛;鄢盛恺;王海蛟;张向辉;赵卫国;;标记免疫分析及其分析仪器的进展[J];中国医疗器械信息;2010年12期

本文编号：2858258