慢病毒介导的TACO基因特异性siRNA对巨噬细胞抗结核分枝杆菌的影响及其相关机制研究

发布时间：2021-10-26 05:25

　　研究目的:构建可表达TACO基因特异性si RNA的慢病毒干涉载体,在此基础上探讨TACO对巨噬细胞清除胞内结核分枝杆菌的影响及相关机制,为后续活体内靶向性抗Mtb感染的研究提供方向和基础。研究方法:1.根据TACO基因的m RNA序列选择3条靶序列,遵照si RNA设计原则设计相应的sh RNA,同时设计一条碱基序列被随机打乱的序列作为对照sh RNA序列。针对各sh RNA分别设计一对单链寡聚脱氧核苷酸,经退火形成相应sh RNA表达的双链DNA片段,再通过切分子克隆的方法将其插入sh RNA慢病毒表达框架质粒p Sico R,获取四个重组慢病毒表达载体p Sico R-TACO-si RNA。经酶切及测序鉴定无误后,将其分别命名为p SRT1-4,其中p SRT4为含对照sh RNA表达序列的慢病毒表达质粒。2.将重组慢病毒干涉载体（p SRT1-4）同膜蛋白质粒p MD2G与慢病毒包装质粒p SPAX2按一定比例混合包装病毒颗粒,收集可表达相应sh RNA的病毒颗粒（分别命名为LV-p SRT1-4）。收集的慢病毒颗粒采用超滤离心管浓缩法进行病毒颗粒的浓缩,再用逐孔倍比稀释法感... 

【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

-1TACO-siRNA序列经退火后双链合成

第 2 章 TACO 慢病毒干涉载体的构建及鉴定2.2 结果2.2.1 TACO 特异性 shRNA 慢病毒表达载体构建成功设计合成的taco-siRNA上下游表达序列片段退火后合成的DNA序列经琼脂糖凝胶电泳后显示在 100bp 处出现相应片段，提示已经成功形成双链 DNA（图2-2-1），再将重组质粒 PSRT1/2/3/4 与原始质粒 pSicoR 经 XhoⅠ和 XbaⅠ双酶切鉴定后，在 300~400bp 处出现相应片段，且重组质粒 PSRT1/2/3/4 相比原始质粒 pSicoR 的片段要略大，与理论预测相符（图 2-2-2）。将 PSRT1/2/3/4 送至测序结果表明，重组质粒的 taco-siRNA 片段已经全部正确插入相应载体开放读码框的正确位点，与设计的 taco-shRNA 序列进行对比分析无突变。（图 2-2-3）

19图 2-2-3 PSRT1、PSRT2、PSRT3、PSRT4 测序波峰图2.2.2 慢病毒包装、滴度检测及感染将 PSRT1/2/3/4 以及 pSicoR 质粒在 293T 细胞中进行慢病毒包装，在完成包装 24h 后，置于荧光倒置显微镜下观察，可检测到 PSRT1/2/3/4 以及 pSicoR 质粒中 GFP 蛋白表达后发出的绿色荧光，其细胞荧光率可达 90%以上（图 2-2-4）。将包装 72h 后病毒液收集浓缩，经倍比稀释后感染 96 孔的 293T 细胞进行滴度检测。在感染后的第 3 天观察荧光计数后根据公式计算，其结果见（表 2-2-1）。其病毒滴度均在 1×108TU/ML 以上，符合转染所需病毒滴度。将浓缩后的病毒


本文编号：3458919