人类白细胞抗原一G与早期胚胎生长发育和着床

　　一、人类白细胞抗原一G(HLA—G)HLA—G是人类主要组织相容性复合体，属非经典性人类白细胞抗原I类基因，由8个外显子和7个内含子组成。HLA—G蛋白有4个膜结合性亚型(HLA—G1、G2、G3、G4)和3个可溶性亚型(HLA一05、G6、G7)。与经典性人类白细胞抗原不同，HLA-G分子多态性有限，只存在有限数量的等位基因。HLA—G 高度选择性地在母胎界面组织表达，主要分布在绒毛外细胞滋养层。母体对胚胎的免疫耐受以及早期胚胎细胞生长发育和着床是妊娠成功的两个关键的因素。近年的研究认为，HLA—G可能与早期胚胎的生殖免疫学和生殖生物学过程密切相关。

　　二、HLA—G在早期胚胎的表达1996年，Jurisicova等 首次发现，人胚胎的卵裂期、桑葚期胚胎及囊胚均有HLA—G 的表达，还发现HLA-G表达胚胎的卵裂率增加。我们的进一步研究发现，人类着床前胚胎表达HLA—G的各个亚型，不同的阶段和不同的胚胎存在表达差异，囊胚内细胞团不表达HLA—G蛋白，滋养层细胞则表达HLA-G蛋白。我们通过检测胚胎干细胞的HLA—G 表达，也证实了胚胎内细胞不表达HLA—G。2002年，Fuzzi等通过检测体外受精(IVF)胚胎培养液发现，人胚胎在4～8细胞阶段分泌可溶性HLA—G(silLA—G)，这一分泌与IVF胚胎的成功着床密切相关。HLA—G在早期胚胎的表达显示其在胚胎早期生长发育和着床上可能发挥作用。

　　三、HLA—G与胚胎生长发育和着床相关性的临床研究近年来，我们开展了sHLA—G与IVF／ICSI结局相关性的多中心回顾性临床研究，探讨HLA—G在胚胎生长发育和着床中的作用。共检测了全国九家生殖医学中心924个IVF周期的2，041份胚胎培养液。结果显示，25．5 (521份)检测到sHLA-G表达。sHLA—G阳性胚胎移植周期的临床妊娠率和胚胎种植率均高于阴性周期(53．9 vs．37．3 ；32．5 vs．23．0 )(P< 0．05)。妊娠相关因素的Logistic多元回归分析显示，sHI A—G 阳性表达与IVF／ICSI妊娠结局呈正相关关系(未发表资料)。

　　此后，我们进一步开展了silLA—G 与IVF／ICSI结局相关性的前瞻性、随机对照临床研究。实验组在冻融胚胎移植(FET)周期中移植sHLA—G阳性胚胎，临床妊娠率66．7%(29／43)，种植率41．3%(38／92)；而对照组在FET 周期中移植sHLA—G阴性胚胎，临床妊娠率50．0%(38／76)，种植率30．3%(56／185)。结果显示，sHLA—G 阳性胚胎有较高的临床妊娠率和种植率(未发表资料)。近年来，国际上的相关研究也显示，分泌sHLA—G的胚胎的IVF／ICSI临床妊娠率和种植率较高。我们对近1O年来sHLA—G 与IVF／ICSI结局相关性研究进行了Meta分析。共检索分析了418篇文献，纳入15篇文献进行Meta分析，研究对象共4，824例。结果显示：与silLA—G 阴性组相比，silLA—G 阳性组种植率、妊娠率和活产率有所提高，合并效应统计量OR依次为：3．19(95 CI：1．30—7．81，P一0．01)、4．43(95％CI：2．85—6．89，P一0．00)和2．47(95 CI：1．21—5．05，P一0．01)，差异均具有统计学意义(未发表资料)。因此，我们认为胚胎sHI A—G检测阳性与IVF／ICSI较好的临床结局相关。但是，sHLA—G与IVF／ICSI妊娠结局间的相关性仍需更精确的检测技术和进一步的分子机制研究。

　　四、HLA—G在胚胎生长发育和着床中作用的分子机制研究为了进一步研究HLA—G在早期胚胎中作用的相关分子机制，我们构建了RNAi腺病毒载体转染人滋养细胞降调节HLA—G模型，笔耕论文新浪博客，采用自然杀伤细胞毒试验观察滋养细胞对自然杀伤细胞的耐受。结果发现，HLA—G降调节后，滋养细胞的免疫耐受下降，提示了HI A～G 在母胎免疫耐受中的可能作用_5j。通过HLA—G在胚胎干细胞的过表达和免疫耐受研究，进一步证实了HLA—G所具有的免疫耐受作用。滋养细胞的粘附和浸润是早期胚胎着床和胎盘形成的关键环节。采用滋养细胞HLA—G降调节模型，我们进一步研究了HLA—G对细胞粘附和浸润的影响，结果发现，HLA—G降调节后，滋养细胞的粘附和浸润能力下降。因此，HLA—G有可能参与胚胎着床相关的粘附和浸润过程。我们采用HLA—G小干扰RNA腺病毒载体转染卵裂期人胚胎，发现转染胚胎的卵裂率和囊胚形成率下降，显示HLA—G可能与胚胎的生长发育相关。

　　为进一步研究sHLA—G在胚胎生长和着床中的分子机制，我们构建了sHLA—G原核细胞表达体系，并采用蛋白重构试剂盒将重组蛋白sHLA—G纯化及重构。采用sHLA—G重组蛋白和滋养层细胞与子宫内膜细胞共培养体外模型，我们研究了silLA—G对滋养细胞和子宫内膜细胞粘附的影响，发现sHLA—G促进滋养细胞与子宫内膜细胞的粘附。应用微量蛋白荧光标记重组sHLA蛋白，与子宫内膜细胞共培养，采用流式细胞仪检测sHLA—G与子宫内膜细胞的特异性结合能力，结果发现sHLA—G与子宫内膜细胞特异结合。进一步采用PCR检测显示，子宫内膜细胞表达HLA—G 受体KIR2DL4。

　　人绒毛膜促性腺激素(HcG)由滋养细胞分泌，在早期妊娠的发生和维持中发挥重要作用。我们研究了HLA—G对滋养细胞生成J3一HCG 的作用及其可能调控机制。采用小干扰RNA转染HI A-G表达阳性的JEG-3滋养细胞，建立HLA—G降调节滋养细胞模型；构建HLA—G 慢病毒载体，感染HLA—G表达阴性的BeWo滋养细胞 ，建立稳定表达HLA—G的滋养细胞模型。通过检测过表达和降调节HLA-G细胞系B—HCG水平显示，HLA—G促进l3一HCG的表达。进一步的研究还显示，HLA—G对8一HCG的调控是通过MEK1／2信号传导通路。

　　HLA—G在早期胚胎的调控机制研究对于阐明其在胚胎生长发育和着床的作用具有意义。白血病抑制因子(LIF)是重要的胚胎种植相关因子。我们研究了LIF对HLA—G的调控机制。采用流式细胞技术和Western blot，我们发现LIF促进滋养细胞表达HLA—G，这一调控作用呈时间和剂量依赖型(未发表资料)。而这一调控是通过MARK信号传导通路完成。我们近年的研究还显示，microRNA在滋养细胞HLA—G的调控中发挥作用。在阳性表达HLA-G 的滋养细胞系JEG一3中过表达miR一152，导致HLA—G的表达下降，NK细胞介导的细胞溶解增加。这一结果提示，miR一152具有降调节HLA—G的作用[Io3。

　　综上所述，HLA—G在早期胚胎的表达、功能和分子机制研究显示，HLA—G在人类早期胚胎的生长、发育、着床等环节上起重要作用。HIA—G有可能成为胚胎生长和着床潜能检测的标志性分子。

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