阿托伐他汀预处理对缺血再灌注心肌线粒体功能的保护机制研究

发布时间：2018-01-12 08:42

本文关键词：阿托伐他汀预处理对缺血再灌注心肌线粒体功能的保护机制研究　出处：《南方医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景和目的随着社会经济的发展,动脉粥样硬化性心血管疾病已经成为危胁国人健康的首位致命病因。急性冠脉综合征是因冠状动脉斑块破裂或糜烂,导致冠状动脉完全或不完全闭塞,冠状动脉血流受阻,引起心肌细胞缺血、缺氧,甚至导致细胞死亡。在急性心肌缺血救治过程中,血运重建恢复冠状动脉血流灌注是最关键措施,心肌恢复血供后缺血组织产生过量的自由基,造成心肌组织更严重的损伤,这通常叫做缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)。阿托伐他汀目前被广泛用于动脉粥样硬化性心血管疾病的临床治疗。既往研究表明,该药具有独立于降脂以外的多效作用,包括改善内皮功能、对抗炎性因子、对抗过氧化损伤等作用。临床研究发现阿托伐他汀可以改善动脉粥样硬化性心血管疾病患者的临床预后,阿托伐他汀的预处理可减少急性心肌梗死面积、减轻缺血再灌注损伤；ARMYDA系列研究表明PCI术前应用阿托伐他汀可以明显减少PCI术后心肌损伤的标志物释放,降低终点事件的发生。动物试验及临床研究均显示,阿托伐他汀具有明确的缺血预适应保护效应。该效应可能与其再灌注心肌线粒体的保护作用有关。阿托伐他汀可能是药物模拟预适应的理想药物。解偶联蛋白3 (Uncompling Protein 3, UCP3)是线粒体内膜蛋白,是内膜的质子载体。UCP3激活可以使氧化磷酸化解偶联减少三磷酸腺苷(adenosine5'triphosphate, ATP)生成,降低跨膜质子梯度,减少线粒体活性氧(Reactive oxygen species, ROS)产生,转运脂肪酸阴离子、减少脂质过氧化物损伤等作用。UCP3被认为是保护线粒体损伤的第一道防线。UCP3在急性缺血再灌注心肌中高表达,说明在缺血再灌注损伤、缺血预适应中具有重要的作用。UCP3的高表达对缺血再灌注损伤心肌有保护作用,可以减轻心肌细胞的损伤、减少心肌梗塞面积、减少I/R诱发心律失常的发生率。但UCP3的心脏保护机制尚不明确。在对UCP3的机制研究中发现,UCP3作用于腺苷酸移位酶(adenine nucleotide translocase, ANT)抑制线粒体膜通透孑L(mitochondrial permeability transitionpore, mPTP)开放,保护线粒体功能。mPTP横跨于线粒体内外膜之间,由线粒体外膜的孔蛋白即电压依赖的阴离子通道、内膜的腺苷酸移位酶和基质的亲环蛋白D组成。缺血再灌注时mPTP的异常开放会破坏线粒体的结构,影响线粒体的功能。mPTP开放抑制剂对缺血再灌注有保护作用,而开放剂氯尼达明可以降低缺血预适应的心肌保护作用。阿托伐他汀和UCP3均被证实有缺血再灌注心肌的保护作用,可能与其抑制mPTP的开放而保护线粒体有关,但详细机制并未阐明,该机制是否通过UCP3途径抑制mPTP开放而发挥线粒体保护作用呢?理论上推测阿托伐他汀可以显著上调PPAR的表达,而PPAR的激活可上调UCP3的表达从而抑制了mPTP的开放,阿托伐他汀对UCP3表达的影响目前尚无相关研究。我们假设UCP3可能是阿托伐他汀潜在的调节靶点之一。阿托伐他汀通过上调UCP3而抑制mPTP开放,减轻线粒体损伤而降低心肌的缺血再灌注损伤。阿托伐他汀和UCP3均有抑制mPTP开放的作用。但]mPTP是线粒体功能调节终末效应器,对于上游有保护作用效应器的调节作用均可影响mPTP的开放。mPTP的作用不足于解释阿托伐他汀和UCP3的生理功能。阿托伐他汀是否通过调节UCP3保护再灌注心肌尚无相关研究。所以本研究旨在观察阿托伐他汀是否通过调节UCP3的表达和功能保护再灌注心肌,应用mPTP开放剂氯尼达明取消mPTP的保护作用,观察氯尼达明对阿托伐他汀心肌保护作用以及对UCP3表达的影响。第1部分缺血再灌注损伤动物模型的建立及单次负荷剂量阿托伐他汀钙预处理的保护作用目的：建立在体SD大鼠缺血再灌注模型,观察阿托伐他汀预处理对再灌注心肌的保护作用,观察氯尼达明对阿托伐他汀保护作用的影响。方法：1、缺血再灌注(Ischemia-reperfusion, I/R)动物模型制作：选择SD大鼠按照如下方法制作I/R模型：全麻下暴露心脏,离前降支起点约2-3mm处用5-0丝线结扎前降支,阻断30分钟后松开再灌注120分钟。2、动物分组：选择SD大鼠20只,随机分为4组,每组5只：(1)假手术组(sham组)：前降支只穿线,不结扎。(2)缺血再灌注损伤组(I/R组)：标准I/R动物模型操作。(3)阿托伐他汀预处理组(Ator组)：I/R操作前12h用阿托伐他汀80 mg/kg灌胃,然后进行I/R操作。(4)阿托伐他汀预处理+氯尼达明组(Ator+LND组)：I／R操作前12h用阿托伐他汀80 mg/kg灌胃,I/R操作前12h用阿托伐他汀80 mg/kg灌胃,然后进行I/R操作,松开结扎线前10分钟经腹腔注射氯尼达明(50mg/kg)。3、观察指标：记录实验动物的体重和左室重量,全程记录大鼠心率、心律变化。采用Evans Blue和TTC法检测缺血再灌注心肌缺血危险区和梗死区面积,用透射电镜观察再灌注心肌的超微结构的变化。4、统计学方法：将数据用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用x±s表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,先用Levene法进行方差齐性检验,若方差齐则采用LSD法行组间比较,若方差不齐采用Tamhane方法行组间比较。组间率的比较使用卡方检验。假设P0.05认为有统计学意义。结果：1、基线资料比较：各组SD大鼠的体重分别Sham组244.08±8.81g、I／R组243.92±10.41g、Ator组246.69±8.23g、Ator+LND组247.62±8.14g,组间比较差异无显著统计学意义(P0.05)。缺血再灌注后各组左心室的重量分别为0.408±0.004g、0.405±0.008g、Ator:0.408±0.006g、Ator+LND:0.409±0.006g,各组间比较差异无显著统计学意义(P0.05)。开胸前基础心率各组分别为354.14±20.76次／分、368.07±16.63次／分、349.95±21.43次／分、346.43±27.48次／分,各组间比较差异无显著统计学意义(P0.05)2、造模过程中的心律失常发生率：与Sham组相比,I/R组再灌注心律失常发生率显著升高(Sham vs I/R: 7.7% vs 46. 2%, P=0.027), Ator组、Ator+LND组心律失常发生率升高,但未达统计学差异(Sham vs Ator: 7.7% vs 23.1%, P=0.277; Sham vs Ator+LND: 7.7% vs 38.5%, P=0. 063)。Ator组(23.1%)、Ator+LND组(38.5%)再灌注后心律失常发生率低于I/R组(46.2%),但未达统计学差异(P0.05)。Ator+LND组再灌注后心律失常发生率高于Ator组,未达统计学差异(P0.05)。3、用缺血危险区面积／左室面积(area at risk/left ventricular, AAT/LV)表示心肌缺血面积比,用梗塞面积／缺血危险区面积(Infarct area /area at risk, IA/AAR)表示梗死面积比。与I/R组相比,Ator组、Ator+LND组的AAR/LV显著减少,具有统计学差异(I/R vs Ator: 46.76±42% vs 40.78±1.40%, P 0. 001 ; I/R vs Ator+LND: 46.76±1.42% vs 43.86±1.07%, P=0.043 ), Ator组、Ator+LND组的IA/AAR显著减少,达统计学意义(I/Rvs Ator:29.16±1.21% vs 21.47±1.65%, P0.001; I/R vs Ator+LND: 29.16±1.21% vs 26.04±1.27%, P=0.024);与Ator组相比,Ator+LND组AAR/LV升高具有统计学意义(Ator vs Ator+LND: 40. 78±1.40% vs 43.86±1.07%, P=0.03), Ator+LND组IA/AAR升高具有统计学意义(Ator vs Ator+LND: 21.47±1.65% vs 26.04±1.27%, P =0.009)。4、透射电镜观察各组超微结构变化发现,I/R组胞质稀疏,分布不均,可见明显水肿。线粒体膜完整性破坏,局部有空泡,嵴断裂,排列紊乱,局部结构消失。Ator组线粒体表达丰富,结构相对完整,可见轻度水肿,嵴突数目略有减少、排列欠整齐,可见少许空泡、线粒体破裂现象。Ator+LND组线粒体可见轻中度肿胀,嵴突变短或断裂,局部可见空泡,部分线粒体完整性破坏,线粒体损伤加重介于I／R组和At or组之间。结论：1、在体大鼠I/R模型建立成功,在缺血再灌注建模前12h阿托伐他汀(80mg/kg)灌胃可以减少I/R损伤程度,氯尼达明部份抵消阿托伐他汀的心肌保护作用,2、阿托伐他汀预处理可以减少I/R损伤性心律失常的发生率。3、阿托伐他汀预处理可以减轻I/R心肌细胞线粒体超微结构损伤。第2部分阿托伐他汀钙预处理对大鼠缺血再灌注心肌UCP3表达和线粒体功能的影响目的：探讨阿托伐他汀预处理对I/R心肌UCP3表达的影响,观察阿托伐他汀对I/R心肌线粒体功能的保护作用,以及氯尼达明对UCP3和线粒体功能的影响。方法：选择SD大鼠32只,随机分为4组(sham组、I/R组、Ator组、Ator+LND组),每组8只,建立在体I/R模型(操作如第一部分)。在再灌注2h后,立即留取心脏标本,用RT-PCR法检测心肌UCP3基因转录水平,Western blot法检测心肌UCP3蛋白表达水平,检测心肌组织三磷酸腺苷(adenosine 5'triphosphate, ATP)含量。留取血标本检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase, SOD)、游离脂肪酸(Free fat acid, FFA)的含量。比较各组各个指标之间的区别。使用Graphpad Prism及SPSS 19.0统计软件进行统计分析,计量资料用x±s表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,若方差齐应用LSD法进行组间比较,方差不齐则采用Tamhane方法进行组间比较,P0.05认为有统计学意义。结果：1、各组UCP3基因转录水平和蛋白含量的比较与Sham组相比,I/R组、Ator组、Ator+LND组UCP3基因表达水平显著升高,差异有统计学意义(Sham vs I/R:1.02±0.17 vs 1.42±0.21, P=0.003; Sham vs Ator:1.02±0.17 vs 1.94±0.31, P0.001; Sham vs Ator+LND:1.02±0.17 vs 1.70±0.28, P0.001);I/R组、Ator组、Ator+LND组UCP3蛋白含量显著升高,有统计学意义(Sham vs I/R: 0.286±0.086 vs 0.420±0.092, P=0.005; Sham vs Ator: 0.286±0.086 vs 0.584±0.099, P0.001; Sham vs Ator+LND:0.286±0.08 vs 0.549±0.068, P0.001)。与I/R组相比,Ator组、Ator+LND组UCP3基因表达水平显著升高,差异有统计学意义(I/R vs Ator:1.42±0.21 vs 1.94±0.31, P 0.001; I/R vs Ator+LND:1.42±0.21 vs 1.70± 0.28, P=0.029); Ator组、Ator+LND组UCP3蛋白含量显著升高,差异有统计学意义(I/R vs Ator:0.420±0.092 vs 0.584±0.099, P=0.001; I/R vs Ator+LND:0.420±0.092 vs 0.549±0.068, P=0.006)。 Ator+LND组UCP3基因表达水平(1.70±0.28)较Ator组(1.94±0.31)略有下降,但未达统计学差异(P0.05)；Ator+LND组UCP3蛋白含量(0.549±0.068)较Ator组(0.584±0.099)略有下降,但未达统计学差异(P0.05)2、各组LDH活性的比较与Sham组相比,I/R组、Ator组、Ator+LND组LDH活性均显著升高,有统计学意义(Sham vs I/R:392.59±55.56 vs 3864.15±162.92U/L, P0.001; Sham vs Ator:392.59±55.56 vs 3056.17±136.22 U/L, P0.001; Sham vs Ator+LND: 392.59±55.56 vs 3578.01±239.41 U/L, P0.001)。与I/R组相比, Ator组、Ator+LND组LDH活性显著降低(I/R vs Ator:3864.15±162.92 vs 3056.17± 136.22 U/L, P0.001; I/R vs Ator+LND:3864.15±162.92 vs 3578.01±239.41 U/L, P=0.001)。 Ator+LND组LDH活性较Ator组明显升高,具有统计学差异(Ator vsAtor+LND: 3056.174±136.22 vs 3578.01±239.41 U/L, P0.001)。3、各组血浆SOD活力的比较与Sham组相比,I/R组、Ator组、Ator+LND组SOD活力明显降低,具有统计学意义(Sham vs I/R: 178.80±7.03 vs 121.17±7.09 U/ml, P0.001; Sham vs Ator: 178.80±7.03 vs 159.53±8.64 U/ml, P0.001; Sham vsAtor+LND; 178.80 ±7.03 vs 143.27±6.15 U/ml, P0.001)。与I/R组相比,Ator组、Ator+LND组SOD活力显著升高(I/R vs Ator: 121.17±7.09 vs 159.53±8.64 U/ml, P0.001; I/R vs Ator+LND: 121.17±7.09 vs 143.27± 6.15 U/ml, P0.001 )。Ator+LND组SOD活力较Ator组显著降低,具有统计学差异(Ator vs Ator+LND: 159.53±8.64 vs 143.27±6.15 U/ml, P0.001)。4、各组血浆MDA组间比较与Sham组相比,I/R组、Ator组、Ator+LND组MDA含量明显升高,具有统计学意义(Sham vs I/R: 2.56±0.58 vs 5.02±0.72nmol/ml, P0.001; Sham vs Ator:2.56±0.58 vs 3.49±0.40nmol/ml, P=0.002; Sham vs Ator+LND: 2.56±0.58 vs 4.45±0.47 nmol/ml, P0.001)。与I/R组相比,Ator组、Ator+LND组MDA含量显著降低(I/R vs Ator: 5.02±0.72 vs 3.49±0.40nmol/ml, P0.001; UR vs Ator+LND: 5.02±0.72 vs 4.45±0.47nmol/ml, P=0.046)。Ator+LND组MDA含量较Ator组显著升高,具有统计学差异(Ator vs Ator+LND: 3.49±0.40 vs 4.45± 0.47 nmol/ml, P=0.002).5、各组心肌组织ATP含量的比较与Sham组相比,I/R组、Ator组、Ator+LND组ATP含量均明显减少,具有统计学意义(Sham vs I/R: 15.62±1.18 vs 11.28±1.86 umol/mL, P0.001; Sham vs Ator: 15.62±1.18 vs 14.13±0.90 umol/mL, P=0.031; Sham vs Ator+LND: 15.62 ±1.18 vs 12.78±1.10 umol/mL, P0.001)。与I/R组相比,Ator组、Ator+LND组ATP含量显著升高(I/R vs Ator: 11.28±1.86 vs 14.13±0.90 umol/mL, P0.001; I/R vsAtor+LND: 11.28±1.86 vs 12.78±1.10 umol/mL, P=0.029)。Ator+LND组ATP含量较Ator组明显下降,具有统计学差异(Ator vs Ator+LND: 14.13±0.90 vs12.78±1.10 umol/mL, P=0.049)。6、各组血浆FFA的比较与Sham组相比,I/R组、Ator组、Ator+LND组FFA含量均明显升高,具有统计学意义(Sham vs I/R: 2384.82±369.11 vs 3494.79±392.49 umol/L, P 0.001; Sham vs Ator;2384.82±369.11 vs 2752.97±299.00 umol/L, P=0.027; Sham vs Ator+LND: 2384.82±369.11 vs 3239.28±245.22 umol/L, P0.001)。与I/R组相比,Ator组、Ator+LND组FFA含量显著降低(I/R vs Ator. 3494.79±392.49 vs 2752.97±299.00umol/L, P0.001; I/R vs Ator+LND: 3494.79±392.49 vs 3239.28±245.22 umol/L, P=0.118)。Ator+LND组FFA含量较Ator组有所升高,但未达到统计学差异(Ator vs Ator+LND: 2752.97±299.00 vs 3239.28±245.22 umol/L,P=-0.005)。结论：1、缺血再灌注使UCP3基因转录水平和蛋白表达水平升高。阿托伐他汀预处理进一步上调了UCP3基因转录和蛋白表达水平。氯尼达明可部分抑制阿托伐他汀上调UCP3表达的作用。2、阿托伐他汀预处理可以减轻心肌的I/R损伤,其机制可能与其减轻脂质过氧化损伤、增强心肌清除自由基的能力以及提高线粒体的ATP保有量有关；而氯尼达明可削弱阿托伐他汀的上述作用。3、阿托伐他汀对UCP3的调节可能与血浆FFA的代谢无关。总结：缺血再灌注加重了心肌损伤,阿托伐他汀预处理对再灌注心肌有保护作用。氯尼达明减部抵消了阿托伐他汀的保护作用。阿托伐他汀可能通过上调UCP3的表达发挥再灌注心肌保护作用。血浆FFA的水平与UCP3的表达规律不一致,阿托伐他汀可能不是通过FFA调节UCP3的表达,其具体调节机制须进一步研究予以探讨。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5

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