大黄及其活性物质灌肠对慢性肾脏病模型大鼠作用的分子机制

发布时间：2018-03-07 23:34

本文选题：大黄　切入点：大黄素　出处：《广州中医药大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:慢性肾脏病(CKD)已成为全球重大的公共卫生健康问题之一。目前对于慢性肾脏病发病及进展的病因病理机制尚未完全清楚。目前临床主要以对症治疗及透析替代治疗为主,且治疗时间长,为社会、家庭以及患者自身带来了沉重的健康以及经济负担。因此,如何延缓CKD进展具有非常重要的社会、经济意义。当今国际肾脏病学界一直致力于探索CKD进展的机制和有效延缓CKD进展的新治疗方法,且中医药已经成为国外预防治疗相关疾病的主要的补充替代治疗方法之一。在我国近50年来,以大黄为主的中药灌肠治疗已作为中医药特色疗法被广泛运用于临床肾脏病治疗,其能有效改善慢性肾脏病便秘等肠道功能障碍,且能清除尿毒素等,具有延缓慢性肾脏病进展的作用,但目前对其机制尚不清楚,国内外相关研究较少。目前国内外越来越多研究显示肠道微生态尤其是肠道菌群与CKD的发生发展密切相关,提出了肠肾轴理论模型,已成为肾病领域的研究热点。因此,本课题试图基于肠肾轴理论模型,从以肠道菌群为中心的肠道微生态的角度去探讨大黄及其活性物质大黄素延缓慢性肾脏病进展的分子机制,为进一步推广中医药特色疗法灌肠以及探讨中医药结肠靶向延缓CKD的防治新策略奠定理论及应用基础。方法:本实验研究分为大黄灌肠及活性物质大黄素灌肠对CKD模型大鼠的作用及其相关机制研究两部分。均采用5/6肾切除模型为CKD模型,大鼠8周成模后随机均分为对照治疗组和实验治疗组,假手术模型为空白对照组。1)在大黄灌肠实验中,选择大黄颗粒剂作为大黄实验用药,采用超高效液质联用及超高效液相色谱法进行大黄颗粒剂指纹图谱检测及大黄素含量定量分析;以无菌水灌肠CKD模型大鼠为对照治疗组(5ml/天),大黄灌肠为实验组,每天给予0.1g/ml大黄颗粒剂溶液(5ml/天,相当于0.3g/ml的生大黄)保留灌肠2min;连续灌肠4周后,收集血液、尿液、肾脏、结肠以及粪便组织,分别检测生化指标(包括全血分析、血肌酐、尿液肌酐比、肌酐清除率以及超敏C-反应蛋白hs-CRP),肾脏病理HE、Masson染色以及肾脏组织纤维化定量,免疫荧光法检测肾脏组织8-OHdG、NF-κB蛋白,Western-blot法进一步检测肾脏组织NF-κB蛋白含量,结肠组织HE染色,新鲜粪便主要进行六种肠道细菌培养(包括肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、真菌、乳杆菌、双歧杆菌),免疫组化法检测结肠固有蛋白claudin-l、occludin的表达、液质联用法检测血清硫酸吲哚酚(IS)水平、鲎试剂法检测血清内毒素脂多糖(LPS)水平,从而评价大黄灌肠对慢性肾脏病模型大鼠肾脏及肠道微生态的影响。2)在大黄素灌肠实验中,以0.4%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液灌肠(5ml/天)慢性肾脏病模型大鼠为对照治疗组,大黄素灌肠组为实验组,每天给予5ml(0.215mg/ml大黄素)大黄素保留灌肠2min,连续灌肠4周后,收集血液、尿液以及粪便组织,分别检测生化指标(包括血肌酐、尿素氮、全血分析、尿蛋白肌酐比以及肌酐清除率),实时荧光定量PCR法检测粪便16SrNDA中主要肠道细菌数量(包括肠杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌),液质联用法检测血清硫酸吲哚酚,鲎试剂法检测血清内毒素脂多糖以及采用二代高通量测序检测粪便肠道菌群16S rNDA,使用Mothurl.29平台和QIIME平台进行相关生物信息学分析肠道菌群二代测序结果。实验获得的计量资料均以均数±标准差的形式表示,使用GraphPad Prism 5.0分析数据,符合正态分布多组之间比较采用单因素ANOVA分析和Student-Newman-Kueuls Q检验进行两两组间比较分析,不符合正态分布则采用非参数检验,两两组间比较采用Cruskal-Wallis H检验。P0.05表示统计学有显著差异。结果:1)大黄灌肠对慢性肾脏病模型大鼠作用及机制的实验结果显示:大黄素单体在大黄颗粒剂中的含量比例为0.215%。与假手术对照组相比,无菌水灌肠组和大黄灌肠组CKD大鼠的血肌酐、尿蛋白肌酐比、LPS水平显著增加(P0.05),而两组肌酐清除率明显降低(P0.05)。与假手术组比,无菌水灌肠组对照组IS和hs-CRP水平均显著增加(P0.05)。与无菌水灌肠组相比,大黄灌肠组则显著降低血肌酐、IS、hs-CRP以及LPS水平(P0.05),明显提高肌酐清除率(P0.05)。HE染色显示在无菌水对照治疗组中,慢性肾脏病大鼠肾脏组织出现明显的管状腔增大、蛋白管型、管状萎缩和伴随许多单核细胞浸润和间质纤维化的间质扩张,结肠组织出现黏膜层水肿且固有层炎症浸润严重,而进行大黄灌肠治疗后则减弱了这些组织病理学变化。肾脏Masson染色显示无菌水对照治疗组中慢性肾脏病大鼠出现显著的肾小管间质纤维化,而经过大黄灌肠治疗4周后,肾小管间质性纤维化的进展明显延迟且肾小管间质性纤维化评分明显降低了约18.75%(P0.05)。无菌水对照组CKD大鼠肾脏组织在肾小球和肾小管中都显示出明显增加的8-OHdG阳性区域,且NF-κ B的表达在肾小球和肾小管中显著增加且western-blot定量其表达明显增加(P0.05),而大黄灌肠治疗后不能减弱肾小球中的8-OHdG表达,但可以减弱其在肾小管中的表达,且减少了残余肾脏中NF-κ B的表达特别是在小管中表达,且western-blot法定量显示其表达明显减少(P0.05)。肠道主要细菌培养结果显示三组之间的Enteroroccus(肠球菌)、Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)和Fungi(真菌)数量没有显著差异。与假手术组相比,无菌水灌肠对照组中的E.coli(肠杆菌)明显增加(P0.05),大黄灌肠实验组的E.coli(肠杆菌)、Lactobacillus(乳杆菌)、Bifidbacteria(双歧杆菌)明显增加(P0.05);与无菌水灌肠对照组相比,大黄灌肠实验组的Bifidbacteria(双歧杆菌)明显增加(P0.05)。与假手术组相比,无菌水灌肠对照组结肠上皮claudin-1和occludin蛋白明显减少,而经大黄灌肠干预后结肠上皮claudin-1和occludin蛋白明显增加。2)大黄素灌肠对慢性肾脏病模型大鼠作用及其机制的实验结果显示:与假手术对照组相比,0.4%CMC-Na对照灌肠组和大黄素灌肠组的血肌酐、尿素浓度和尿蛋白肌酐比明显增加(P0.05),而血红蛋白、血细胞比容水平、肌酐清除率和体重则明显降低(P0.05)。与假手术组相比,0.4%CMC-Na灌肠对照组IS和LPS水平显著增加(P0.05)。与CMC-Na灌肠对照组相比,大黄素灌肠组则明显降低尿素氮浓度、尿蛋白肌酐比、IS以及LPS水平(P0.05)。实时荧光定量PCR检测结果显示三组之间的所有细菌的总数没有显著变化。与假手术组相比,CMC-Na灌肠对照组中的Cl0stridium Perfringens(产气荚膜梭菌)明显增加(P0.05),而 Lactobacillus(乳杆菌)显著降低(P0.05)。与CMC-Na灌肠对照组相比,大黄素灌肠实验组的Lactobacillus(乳杆菌)明显增加(P0.05),E.coli(肠杆菌)、Enteroroccus(肠球菌)和ClostridiumPerfringens(产气荚膜梭菌)显著减少(P0.05)。二代测序结果共得到128,238个序列,共3,744个OTUs,平均每个样品为488±120个OTUs,测序样本稀释曲线以及a多样性分析均显示测序样品已经具有其大部分特征且捕获了其菌群多样性,加权UniFracPCoA分析显示三组相互偏离,以表示其各组肠道菌群结构差异大。在门分类上,相比于假手术组或CMC-Na灌肠对照组,大黄素灌肠实验组Tenericutes门明显增加(P0.05)。在属分类上,与假手术组相比,CMC-Na灌肠对照组中乳杆菌属明显减少(P0.05)。与CMC-Na灌肠对照组中相比,大黄素灌肠实验组组的未分类来自S24-7科的属和梭菌属明显减少(P0.05),而来自RF39目未分类属和拟杆菌属显著增加(P0.05),乳杆菌略有增加。且发现梭菌属与尿素氮和IS明显正相关(P0.05),普雷沃氏菌属、乳杆菌属与尿素氮显著负相关性(P0.05)。结论:通过进行大黄灌肠对CKD大鼠模型的作用及其机制的研究,我们可知大黄灌肠可以延缓CKD进展,其可能的分子机制主要是通过调节肠道微生态主要包括调节肠道菌群主要增加双歧杆菌益生菌的数量、恢复固有黏膜蛋白claudin-1、occludin以及减少内毒素LPS水平,减少CKD状态的尿毒素IS生成,从而缓解CKD的系统炎症,进一步改善肾功能、肾脏炎症氧化应激及肾纤维化。可见大黄灌肠具有多靶点多层次作用于CKD大鼠的特点。我们进一步进行了大黄中有效活性物质大黄素单体物质对CKD大鼠模型的作用及其分子机制探索。结果充分表明了大黄素灌肠治疗可以减少尿毒症毒素尿素氮以及肠源性尿毒素IS,减少血清LPS水平,从而减少系统炎症和肾损害,其可能的重要机制是调节肠道微生物群的结构,尤其是减少了有害细菌(例如梭菌属Clostridium),包括产气荚膜梭菌种C.Perfringens)的数量,并且增加了肠道中有益细菌例如乳杆菌属(Lactobacillus)的数量,且进一步发现致病菌属梭菌属与尿素氮和IS尿毒素水平明显正相关,而益生菌普雷沃氏菌属、乳杆菌属与尿素氮明显负相关。从而进一步明确了大黄活性物质大黄素可直接作用于相关肠道菌群靶点,其主要参与了大黄延缓CKD进展分子机制中最重要的调节肠道菌群环节,为大黄的药理机制以及相关延缓CKD进展从肠道微生态角度出发的分子机制奠定坚定的物质基础以及理论基础。
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【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5;R-332

【参考文献】