表达基因Ⅶ型新城疫病毒HN糖蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建及其免疫效力试验

发布时间：2018-05-15 18:01

  本文选题：新城疫病毒 + 火鸡疱疹病毒　； 参考：《扬州大学》2017年硕士论文

【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种烈性、高度传染性疾病,给养禽业带来了巨大的经济损失。目前,常规疫苗毒株大多是NDV基因Ⅰ型或基因Ⅱ型,而当前我国优势流行毒株为NDV基因Ⅶ型,虽然它们属于同一血清型,但遗传距离相差较远。因此,免疫鸡群中非典型ND和带毒现象普遍存在,免疫失败时有发生,迫切需要研制与流行毒株基因型相匹配的ND疫苗。火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkey,HVT)疫苗是预防鸡马立克氏病的常用疫苗,具有较多的病毒复制非必需区可供外源基因的插入,被广泛应用于重组病毒活疫苗的构建。本研究拟以HVTFC126疫苗株为载体,构建表达基因Ⅶ型NDVHN糖蛋白的重组火鸡疱疹病毒,研制新型ND活疫苗。本研究通过PCR扩增出基因Ⅶ型NDVDT-2014株的HN基因,与人巨细胞病毒早期启动子(CMV)和TK poly A组成表达盒。将该表达盒插入到HVT FCl26疫苗株的US2非必需区片段中,构建转移载体pHVT-US2-HN。将pHVT-US2-HN转移载体与表达EGFP标志基因的重组HVT FC126病毒(rHVT-EGFP)基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经同源重组,将EGFP基因替换为HN基因表达盒,获得表达HN蛋白的重组病毒rHVT-US2-HN。通过 PCR、Southern-blot、Western-blot 和间接免疫荧光试验(IFA)对获得的重组病毒rHVT-US2-HN进行鉴定,并对其在CEF上的生长特性进行检测。结果显示:重组病毒rHVT-US2-HN中,HN基因表达盒已正确插入US2复制非必需区内,并能成功表达大小在70kD左右的目的蛋白。同时,重组病毒rHVT-US2-HN在CEF上表现出了与HVTFC126疫苗毒株相同的复制水平。本研究对重组病毒rHVT-US2-HN进行了免疫效力的初步评价。将80只1日龄SPF鸡随机分成4组,依次为rHVT-US2-HN免疫组、弱毒疫苗免疫组、攻毒对照组及空白对照组。其中,rHVT-US2-HN免疫组于1日龄颈部皮下接种5000噬斑形成单位(PFU)的rHVT-US2-HN;弱毒疫苗组于7日龄经滴鼻/点眼途径免疫1羽份LaSota疫苗。分别于7、14、21、28日龄采血分离血清,通过血凝抑制试验(HI)检测NDV抗体效价。除空白对照组外,其余3组于21日龄经滴鼻点眼途径以每只鸡105EID50的基因Ⅶ型NDV DT-2014株攻毒。攻毒后第3d、5d,采集喉头、泄殖腔拭子,进行病毒分离,检测各组试验鸡的排毒情况;并连续观察7天,统计各试验组的临床症状、发病率和死亡率。结果显示:rHVT-US2-HN免疫组试验鸡在接种后抗体水平呈上升趋势。攻毒后7天,对照组的死亡率为100%,rHVT-US2-HN免疫组的死亡率为50%,弱毒疫苗免疫组的死亡率为10%。表明重组病毒rHVT-US2-HN对基因VII型NDV强毒株的攻击有一定的免疫保护效果,为ND的预防和控制提供了新的候选疫苗株。
[Abstract]:Newcastle disease (NDV) is a severe and highly infectious disease caused by Newcastle disease virus (NDV), which has brought great economic losses to poultry industry. At present, most of the conventional vaccine strains are NDV gene type 鈪，

本文编号：1893351