花椒细胞悬浮培养及原生质体分离

发布时间：2018-05-31 23:40

本文选题：花椒 + 细胞悬浮培养　；参考：《西北农林科技大学》2016年硕士论文

【摘要】：花椒(Zanthoxylum bungeanum)是陕西省重要的经济树种,其中以凤县大红袍花椒和韩城大红袍花椒栽植面积最广,经济价值最高。近年来,随着花椒新途径的不断开发,市场对花椒的需求量正在不断攀升。为了满足当前花椒产业发展的需要,开展花椒良种选育和繁殖工作迫在眉睫。但花椒属于无融合生殖植物,人工杂交十分困难,目前花椒遗传改良主要依靠自然变异,但变异率低及变异的不确定性,使得花椒种质资源创新和良种繁育工作一直没有取得突破性进展。现代生物技术的发展和林木体细胞杂交技术的不断成熟,为花椒育种提供了新思路和新方法。利用体细胞杂交技术能够实现凤县大红袍花椒和韩城大红袍花椒优良性状的聚合,但必须以获得高产率和高活力的原生质体为前提。为了便于杂种细胞地筛选,常用的方法之一是两个亲本种分别从不含叶绿体的细胞(如愈伤组织细胞和悬浮培养细胞)和含有叶绿体的细胞(如叶肉细胞)分离的原生质体进行融合。课题组前期已建立了凤县大红袍花椒组织培养再生体系,但其愈伤组织培养以不定芽诱导为目的,结构致密,不适于花椒细胞悬浮系的构建和原生质体分离,试管苗增殖培养基也不一定适用于韩城大红袍花椒。因此,本文在课题组前期研究的基础上,以花椒体细胞杂交为最终目的,开展了3方面基础性研究工作:第一,韩城大红袍花椒茎段培养与快速繁殖;第二,凤县大红袍花椒愈伤组织继代培养,获得生长旺盛、结构松散的愈伤组织,并以此建立花椒细胞悬浮系;第三,以韩城大红袍花椒试管苗叶片,以及凤县大红袍花椒愈伤组织、悬浮培养细胞为材料,研究了花椒原生质体分离与纯化技术体系。主要研究结果如下:1.花椒茎段培养与快速繁殖以韩城大红袍花椒带芽嫩茎为试验材料,研究了花椒茎段培养与快速繁殖培养条件。结果表明:最适0.1%升汞消毒时间为10-13 min,最佳取样时期为4-5月;最适腋芽萌发培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+GA3 2.0mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂6 g·L-1;最适腋芽增殖培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.5mg·L-1+GA3 2.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂6 g·L-1,增殖系数达4.6;生根培养基为1/4MS+IBA 0.4 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂6 g·L-1,可生根1-4根,生根率达80%以上。2.花椒细胞悬浮培养以凤县大红袍花椒试管苗叶片为试验材料,研究了激素配比对花椒愈伤组织继代培养的影响,并以多次继代得到的疏松、活性高的愈伤组织建立花椒细胞悬浮系。结果表明:花椒愈伤组织的最适继代培养基为MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂6 g·L-1;花椒细胞悬浮培养的最佳培养基和培养条件为MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+葡萄糖30 g·L-1,接种量0.05 g·mL-1,摇床转速110 rpm,25℃暗培养,该条件下悬浮培养细胞生长良好,最大生长量为4.52 g;花椒悬浮培养细胞生长呈“S”型曲线,最适继代周期为16 d。3.花椒原生质体分离与纯化以韩城大红袍花椒叶片、凤县大红袍花椒愈伤组织和悬浮培养细胞为实验材料,利用酶解法分离原生质体,通过单因素实验分别研究酶液浓度、酶解时间、甘露醇浓度以及蔗糖浓度对花椒原生质体分离和纯化的影响,原生质体产量和活力统计分别采用血球计数板计数法和荧光素双醋酸酯(FDA)染色法。结果表明:以花椒叶片分离原生质体的最适酶液组成为CPW-0.7 mol·L-1甘露醇+1.0%(w/v)纤维素R-10+1.5%(w/v)果胶酶,最适酶解时间为10 h,蔗糖浓度30%(w/v)时原生质体纯化效果最佳,原生质体产量和活力分别可达82.36×105个·g-1和72.74%;以愈伤组织和悬浮培养细胞为分离材料的最适酶液组成均为CPW-0.6 mol·L-1甘露醇+2.0%(w/v)纤维素酶R-10+0.5%(w/v)果胶酶,最适酶解时间为12 h-14 h,纯化原生质体的蔗糖浓度以25%(w/v)-30%(w/v)为宜,原生质体产量及活力分别为31.26×105个·g-1、59.15%和53.87×105个·g-1、63.92%;高浓度蔗糖纯化花椒原生质体有利于提高原生质体产量,但会导致原生质体活力迅速下降;叶片是花椒原生质体分离的最佳材料,其次是悬浮培养细胞,而从愈伤组织分离的原生质体产量和活力最低。
[Abstract]:In order to meet the needs of the development of Chinese prickly ash , it is very difficult to breed and reproduce the pepper . The results showed that the optimum medium and culture conditions were MS + 2,4 - D 1.0 mg 路 L - 1 + 6 - BA 0.5 mg 路 L - 1 + sucrose 30 g 路 L -1 + sucrose 30 g 路 L -1 + sucrose 30 g 路 L -1 + agar 6 g 路 L -1 . The optimum medium and culture conditions were as follows : MS + 2,4 - D 1.0 mg 路 L -1 + 6 - BA 0.5 mg 路 L -1 + sucrose 30 g 路 L -1 + agar 6 g 路 L -1 . The yield and viability of protoplasts were 31.26 脳 105 路 g - 1 , 59.15 % and 53.87 脳 105 路 g - 1 , 63.92 % respectively .
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S573.9

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