【摘要】：第一部分:细菌对家蚕中肠转录组的调控。天生免疫系统是动物抵御入侵微生物的第一道防线,该系统从昆虫到人类广泛存在,具有很强的保守性。与人类中的“病从口入”一样,大多数的致病微生物是由昆虫口器通过取食进入体内的。因此,肠道首当其冲受到细菌的侵害。但与此同时,肠道可以通过物理屏障和生理反应来阻止入侵病原物破坏肠道,并阻止病原物透过肠道进入血淋巴。在果蝇(Drosophila melanogaster)中,肠道免疫由活性氧(reactive oxygen species,ROS)和抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)两道防线组成,可有效地抵御入侵病原物并维持肠道内共生菌的稳态。作为鳞翅目昆虫,家蚕(Bombyx mori)不仅是一种重要的经济昆虫,还是一种重要的模式昆虫,但对家蚕肠道免疫系统与入侵细菌之间的相互作用知之甚少。通过对家蚕肠道免疫的研究,我们期望揭示鳞翅目昆虫肠道免疫作用机制,为蚕病的防治及鳞翅目害虫的生物防治打下基础。本研究对喂食感染黑胸败血菌(Bacillus bombysepticus)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)后的家蚕幼虫中肠进行转录组测序,并进行了生物信息学分析、实时定量PCR、肠道内ROS的测定、肠道内细菌数目变化的统计以及肠道消化液抗菌活性的分析,旨在揭示家蚕肠道免疫的机制。主要结果如下:(1)通过死亡率实验我们发现在细菌感染的前期,喂食感染黑胸败血菌的家蚕死亡率高于假结核耶尔森氏菌感染的家蚕,但在细菌感染的后期,喂食感染假结核耶尔森氏菌的家蚕死亡率高于感染黑胸败血菌的家蚕。(2)基于对家蚕转录组聚类分析和维恩图分析,我们发现不同的细菌会引起家蚕中肠不同基因的转录变化;ROS代谢相关的基因在细菌感染的前期出现上调而抗菌肽基因则在细菌感染的后期出现上调。(3)通过Gene Ontology(GO)富集分析我们发现4 h和24 h时黑胸败血菌感染组中显著富集出来的terms明显多于假结核耶尔森氏菌感染组中显著富集出来的terms,48 h时假结核耶尔森氏菌感染组中显著富集出来的terms明显多于黑胸败血菌感染组中显著富集出来的terms。这一结论说明相对于阴性菌假结核耶尔森氏菌,黑胸败血菌在感染的前期可引发家蚕中肠更强烈的反应。(4)通过KEGG分析发现在黑胸败血菌和假结核耶尔森氏菌感染的后期,家蚕肠道内的能量代谢途径显著富集并上调,表明家蚕在对抗肠道内入侵的细菌时会导致自身大量的能量消耗。(5)实时定量PCR和肠道内ROS的测定证实转录组分析得到的结论——“ROS相关的基因在细菌感染的前期出现上调,而抗菌肽基因则在细菌感染的后期出现上调”。肠道内细菌数目变化的统计以及肠道消化液抗菌活性的分析再次证实这一结论,表明在家蚕中肠免疫系统中ROS在细菌感染的初期扮演着重要的角色,而抗菌肽则主要在细菌感染的后期起作用。另外我们发现Toll途径可能也参与家蚕肠道免疫反应。结论:黑胸败血菌和假结核耶尔森氏菌以不同的方式调控家蚕中肠转录组;黑胸败血菌和假结核耶尔森氏菌感染后会引起家蚕中肠能量消耗增加;在家蚕中肠免疫系统中ROS在细菌感染的初期扮演着重要的角色,而抗菌肽则主要在细菌感染的后期起作用。Toll途径可能也参与家蚕肠道免疫反应。第二部分:家蚕肽聚糖识别蛋白PGRP-S5的功能分析。天生免疫反应的起始由模式识别蛋白(pattern recognition proteins,PRRs)识别病原微生物表面特有的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)发动。肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)是PRRs的重要成员,有些PGRPs可以识别细菌细胞壁中的PAMP-肽聚糖(peptidoglycans,PGs)并激活昆虫的免疫反应抵御入侵病原物;有些PGRPs可以参与免疫反应的调控;还有一些PGRPs可以作为效应因子直接作用于入侵的病原物。家蚕基因组编码12个PGRPs,前期实验中我们发现细菌感染后家蚕PGRP-S5在脂肪体、血细胞和中肠中的表达上调。为了研究PGRP-S5的功能,我们体外重组表达了家蚕PGRP-S5和其突变型C177S并进行活性分析,并通过体内实验分析PGRP-S5的功能。主要结果如下:(1)PGRP-S5可以识别细菌PGs并激活酚氧化酶级联反应,并且在这一激活过程中PGRP-S5的酰氨酶活性是必需的。(2)PGRP-S5依赖其酰胺酶活性通过通过IMD途径负调控家蚕抗菌肽的合成。(3)PGRP-S5能够结合细菌的PGs,并能引发细菌凝集。但C177位点不影响PGRP-S5对细菌PGs的结合和对细菌的凝集。(4)PGRP-S5具有酰氨酶活性和抗菌活性,并且其抗菌活性依赖于其酰胺酶活性,C177位点是PGRP-S5酰胺酶活性关键位点。结论:家蚕PGRP-S5可以作为模式识别受体引发酚氧化酶原途径的激活,可以作为效应因子抑制细菌的生长,并且可以依赖其酰胺酶活性通过IMD(IMmune Deficiency)途径负调控家蚕抗菌肽合成。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q966
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2381383
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