线粒体内膜ATP敏感性钾通道在慢性间歇性低压低氧预处理对脑缺血耐受的诱导中的作用及机制研究

发布时间：2020-02-16 20:41

【摘要】：脑缺血是以脑循环血流量减少为特征的脑血管疾病,具有高发病率、高致残率、高致死率的特点,已成为全球性的健康问题。而缺血性脑卒中约占脑卒中的70%-80%,不容忽视。我国卫生部2011年发布的《中国卒中宣言》指出,脑卒中已经成为我国第一大致死疾病,发病率高居世界首位。在我国,每年用于脑卒中患者的医药费和护理费等开支巨大,给患者家庭和社会带来了沉重的经济负担,也给临床护理人员带来了繁重的护理负担。因此,脑缺血的预防显得尤为重要,脑缺血一级预防的意义远大于二级和三级预防,即在尚未出现卒中或有危险因素时即给予干预和护理,降低卒中风险,提高机体自身抵抗能力,以达到避免或减少卒中的损害严重程度的目的。目前亟需安全有效的一级预防措施。慢性间歇性低压低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia,CIHH)对机体具有多种有益效应,长时间以来都被用于一些疾病的预防和治疗,但其可否用于预防脑卒中及其相关机制还待进一步研究。近年,线粒体作为脑缺血性损伤的亚细胞靶目标,在脑保护中的作用越来越受到重视。研究发现,脑缺血预处理与线粒体内膜ATP敏感性钾通道(mitochondrial membrane ATP sensitive potassium channels,mito KATP)有关,应用mito KATP的阻断剂5-羟基癸酸盐(5-hydroxydeenoate,5-HD)可以阻断脑缺血耐受,提示mito KATP可能也参与了脑缺血耐受的形成,但mito KATP在CIHH诱导脑缺血耐受过程中的作用还不十分清楚。目的:建立大鼠全脑缺血模型,明确CIHH可以诱导脑缺血耐受,并探讨mito KATP通道在其中的作用及其可能机制。方法:健康雄性Wistar大鼠随机分为以下7组:(1)对照组(Control组):不接受任何处理;(2)假手术组(Sham组):永久凝闭双侧椎动脉,2 d后游离双侧颈总动脉,但不夹闭;(3)慢性间歇性低压低氧组(CIHH组):大鼠接受模拟5000米海拔低压低氧环境,每天6小时,持续28天的CIHH适应处理;(4)脑缺血组(ISH组):永久凝闭双侧椎动脉,2 d后夹闭双侧颈总动脉8 min致全脑缺血;(5)慢性间歇性低压低氧+脑缺血组(CIHH+ISH组):大鼠接受模拟5000米海拔低压低氧环境,每天6小时,持续28天的CIHH适应处理后,永久凝闭双侧椎动脉,2 d后夹闭双侧颈总动脉8 min致全脑缺血;(6)缺血前30分钟给予5-HD腹腔注射(40 mg/kg),其余实验步骤同第5组;(7)5-羟基癸酸盐+假手术组(5-HD+Sham组):永久凝闭双侧椎动脉,2 d后游离双侧颈总动脉前30分钟给予5-HD腹腔注射(40 mg/kg),但不夹闭颈总动脉。实验观察内容包括如下步骤:(1)实验动物于造模完成后30天开始采用Morris水迷宫实验(Morris water maze,MWM)观测各组实验动物学习记忆行为学功能,在行为学实验结束后,取海马行硫堇染色观察CA1区锥体神经元迟发性坏死(delayed neuronal death,DND)情况。(2)CIHH预处理结束后0 h,6 h,1 d,3 d,7 d和10 d等各时间点海马CA1区mito KATP的亚基Kir6.2,SUR1的蛋白的动态表达。(3)mito KATP的亚基Kir6.2,SUR1于缺血后2 d和7 d时在海马CA1区不同组间的蛋白表达比较;(4)在缺血后1 d时(其他各组在相应时间点),取海马CA1区,采用western blot技术分别观察Cytochrome c在线粒体和胞浆中的蛋白表达情况,来比较CIHH预处理是否抑制了缺血所引起的凋亡;(5)在缺血后1 d时(其他各组在相应时间点),取海马CA1区,采用流式细胞技术观察各组神经元线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,ΔΨm)的变化,通过使用5-HD来验证CIHH预处理诱导的脑缺血耐受是否由mito KATP介导;(6)在缺血后3 d时(其他各组在相应时间点),取海马CA1区组织,采用透射电镜观察不同处理组椎体神经元及线粒体超微结构。统计学处理数据采用均数±标准差(mean±SD)表示,应用SPSS21.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理,各时间点两组间比较采用两独立样本t检验,多组之间的两两比较采用多样本方差分析,HG采用Kruska-Wallis法进行多样本等级资料的秩和检验,P0.05认为差异有统计学意义。结果:1在水迷宫的寻台潜伏期实验中,各组大鼠随着训练增加,逃避潜伏期均呈现出逐渐缩短的趋势。Sham组和CIHH组大鼠相比,逃避潜伏期无显著性差异;在第4天时,ISH组大鼠的逃避潜伏期比Sham组明显延长(P0.05);CIHH+ISH组的逃避潜伏期跟ISH组相比又出现了缩短了(P0.05);5-HD+CIHH+ISH组的逃避潜伏期比CIHH+ISH组延长(P0.05),5-HD+Sham组和Sham组无显著差异。在空间探索实验中,Sham组和CIHH组在原平台所在象限停留时间占总时间百分比无差异;ISH组在目标象限的停留时间百分比与Sham组相比明显减少(P0.05);然而CIHH+ISH组与ISH组相比,在目标象限的停留时间百分比明显增加(P0.05);当提前应用了5-HD阻断mito KATP后,在目标象限的停留时间百分比又减少至接近ISH组水平(P0.05);5-HD+Sham组和Sham组无显著差异。2硫堇染色显示,Sham组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、致密,约2-3层,细胞结构形态完整,边界清晰,尼氏小体丰富,胞核大且圆、核仁清晰可见。CIHH组大鼠海马CA1区神经元未见明显损失,与Sham组相比,无明显变化。ISH组大鼠海马CA1区可见神经元几乎全部死亡,细胞结构形态发生明显改变,胞体缩小,形态不规则,呈多角形或梭型,胞膜皱缩,胞核固缩,核仁模糊不清甚至消失;CIHH+ISH组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、致密,胞核饱满,核仁较清晰,仅有个别胞核固缩,无明显细胞缺失。应用5-HD后,组织学表现又接近ISH组。5-HD+Sham组和Sham组无显著差异。3与Con组相比,CIHH处理28天后0h,6 h,1 d,3 d,7 d mito KATP的两个亚基Kir6.2和SUR1的蛋白表达均显著增高(P0.05),CIHH后10d无明显差异。4 CIHH处理28天后2天或7天,与Sham组相比,CIHH组mito KATP的两个亚基Kir6.2和SUR1的蛋白表达显著增高(P0.05),与ISH组相比,CIHH+ISH组线粒体亚基Kir6.2和SUR1的蛋白表达显著增高(P0.05)。5与Sham组相比,CIHH组大鼠海马组织胞浆内Cytochrome c明显减少(P0.05),与ISH组大鼠相比,CIHH+ISH组大鼠胞浆内Cytochrome c明显减少(P0.05),与CIHH+ISH组大鼠相比,5-HD+CIHH+ISH组大鼠胞浆内Cytochrome c明显增多(P0.05),而线粒体内的Cytochrome c的变化与胞浆内相反。6与Sham组相比,ISH组ΔΨm的水平显著降低(P0.05),与ISH组相比,CIHH+ISH组能明显抑制ΔΨm的水平的降低,保持ΔΨm水平的稳定(P0.05),与CIHH+ISH组相比,5-HD+CIHH+ISH组ΔΨm水平明显降低(P0.05),说明5-HD取消了CIHH对ΔΨm水平降低的抑制作用。7与Sham组相比,CIHH组无明显变化,ISH组中线粒体的超微结构发生明显改变,表现为广泛的空泡化、严重的嵴断裂以及伴有膜破坏;而CIHH+ISH组可部分改善线粒体的结构变化,5-HD+CIHH+ISH组与CIHH+ISH相比,其线粒体又出现了明显损伤,其表现与ISH组的线粒体超微结构相似。结论:1 CIHH预处理可以诱导脑缺血耐受,减轻缺血造成的神经元迟发性坏死、线粒体超微结构损伤以及学习记忆的损伤。2 CIHH预处理上调了海马CA1区神经细胞的mito KATP的两个亚基Kir6.2和SUR1的表达,并且对抗了脑缺血所致的两个亚基表达的降低。3 CIHH可以对抗脑缺血时线粒体膜电位的下降和线粒体凋亡的启动蛋白Cytochrome c的外流。4通过使用5-HD特异性阻断mito KATP,验证了mito KATP是通过上调其两个亚基的蛋白表达和活性来参与CIHH诱导的脑缺血耐受的。
【图文】：

功能图,学习记忆行为,大鼠,功能

1. Morris水迷宫实验检测各组大鼠的学习记忆行为学功能结果。均数±标准差表示，，n=10。* P < 0.05 与假手术组相比，△P < IHH 组相比，#P < 0.05与ISH组相比，+P < 0.05与CIHH + ISH组相ig.1Spatial learning and memory ability conducted one month after isith the Morris water maze. Data are expressed as the mean ± SD, reach group.* P < 0.05 vs. Sham group,△P < 0.05 vs. CIHH group,#Ps. ISH group,+P < 0.05 vs. CIHH + ISH group.17

柱形图,组织病理学变化,CA1区,硫堇

研究论文图2. 各组大鼠海马CA1区的组织病理学变化的观察。图中最上方是硫堇染色图片 (标尺在图a中为400 μm，b-g为 25 μm)。中间的点状图和最下方的柱形图是组织学分级和神经元密度。每个点代表一只动物，位置代表此动物的分级。数据均用均数±标准差表示，n=10。*P<0.05 vs sham组，# P<0.05 vs 缺血组，+P<0.05 vs CIHH+缺血组。Fig.2 Histological changes in the CA1 hippocampus area. The upper panels arerepresentative thionine-stained photomicrographs (scale bar is 400 um in a and25 um in b-g). The lower dot and bar graphs are quantitative presentations ofthe histological changes with histological grade and neuronal density. Each dotrepresents one animalassigned that grade. Data are expressed as the mean±SD,n = 10 for each group.* P < 0.05 vs. Sham group,#P < 0
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.3

【参考文献】