光学生物传感中信号放大策略与石墨烯类纳米材料的应用

发布时间：2018-06-07 12:40

本文选题：生物传感器 + 核酸探针　；参考：《湖南大学》2015年博士论文

【摘要】：现代社会的快速发展对分析化学,特别是对生化分析提出了更高的要求,发展新的分析方法和技术以解决越来越多的分析难题和社会热点问题为分析化学科研工作者提出了严峻的挑战。近年来,生物传感技术因其灵敏度高、选择性好、响应速度快、检测成本低等优点,为生物医学和分析化学领域的研究提供了新的思路和技术支持,极大地推动了生物医学、临床诊断和药物筛选的发展。此外,光学检测技术因其具有操作简便、响应速度快、易于实现等优点,在生化分析领域受到了广大研究者的关注。本论文结合功能核酸分子探针、纳米材料和光学检测技术的优势,建立了一些生物传感新方法用于碱基切除修复酶活性及其抑制剂、p H、核酸、小分子、micro RNA表达水平的分析与测定。和传统方法相比,本论文建立的分析方法操作简便、灵敏度高、选择性好、分析速度快,并通过对实际样品的分析,初步验证了这些方法的实用性。具体内容如下:DNA损伤的修复在保持基因完整性中起着重要作用,碱基切除修复作为保护细胞免受DNA损伤影响的主要途径之一,其修复酶的活性和多种疾病相关。第2章中,以尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)为目标分析模型,基于杂交链式放大反应和氧化石墨烯的荧光淬灭能力,建立了一种无酶参与的循环放大策略用于碱基切除修复酶的高灵敏检测。UDG能够切除发夹探针的尿嘧啶碱基并产生脱碱基位点,降低了发夹探针的熔链温度,导致发夹探针结构不稳定,释放出单链,从而引发杂交链式反应,利用氧化石墨烯区分单双链以及较强的荧光淬灭能力,实现了对UDG的高灵敏检测。该方法具有较宽的动态响应范围和较低的检测限,其线性检测范围为0.0001-100 U/m L,检测下限为0.00006 U/m L。此外,该方法也被成功用于UDG抑制剂的测定,并且还适用于复杂体系中UDG活性的测定。本方法设计简单、灵敏度高且选择性好,有望为UDG活性分析和相关的生物学研究提供一个低成本、高灵敏的均相分析检测平台。细胞内p H是细胞生理活动中的重要调控因子之一,p H的检测在研究生理和病理过程中具有重要作用。第3章中,基于不同p H条件下会导致DNA构象的变换,以氧化石墨烯为荧光淬灭剂,构建了一种简单、快速的p H分析方法。实验设计了一条p H敏感的DNA探针,在酸性条件下,DNA探针以三链结构存在于溶液中,而在弱碱性条件下,DNA探针以发夹结构存在。由于DNA三链结构刚性较强,与氧化石墨烯的结合力较弱,氧化石墨烯不能有效淬灭标记在DNA探针上荧光染料的荧光,因此得到较强的荧光信号;然而,在弱碱性条件下,氧化石墨烯可以与DNA发夹的粘性末端结合,有效地淬灭了DNA探针的荧光,得到较弱的荧光信号,从而实现对p H的快速检测。生命体中核酸和小分子的研究对生物医学和临床诊断有着非常重要的意义。第4章中,我们利用湿法化学方法合成了石墨烯-血红素杂化纳米片(GHs),并且通过实验发现,合成的GHs不仅具备过氧化物酶活性,而且具有区分单双链DNA的能力。基于GHs的特殊性质,发展了一种非标记的比色策略用于核酸和小分子的检测。该方法操作简单,成本较低,有望成为核酸和小分子检测的一种常用方法。Micro RNA是一类内源性表达的长度约19-25个核苷酸的非编码RNA分子,在细胞内参与组建沉默复合物与目标m RNA杂交,通过抑制靶m RNA的降解和蛋白质的翻译实现蛋白表达的调控。最新研究发现micro RNA表达水平的变化与许多疾病和癌症的发生息息相关,并且其有望成为新的临床诊断与治疗的生物标志物。第5章中,基于甲氧檗因可以与多聚腺苷酸特异性结合的性质,利用核酸嵌入染料SYBR Green I作为荧光指示剂,开发了一种非标记荧光方法用于micro RNA的检测。甲氧檗因可以和多聚腺苷酸以1:4的比例特异性结合,形成(腺苷)2-甲氧檗因-(腺苷)2复合物,因此,它可以将同源的多聚腺苷酸折叠成一条反平行结构的双链。利用poly(A)聚合酶在mi RNA 3′端延伸出一个poly(A)-tail,通过甲氧檗因与poly(A)-tail之间的特异性结合,将poly(A)-tail折叠成一条反平行结构的双链,经SYBR Green I染色后,产生较强的荧光信号,从而实现对目标micro RNA的非标记荧光检测。第6章中,基于二硫化钨纳米片的荧光淬灭能力,结合双链特异性核酸酶信号放大策略,提出了一种新型荧光分析方法用于micro RNA的高灵敏检测。本章首次提出二硫化钨纳米片可以作为一种荧光染料淬灭剂,可以有效的淬灭荧光染料分子的荧光,并且,该纳米片对不同长度寡核苷酸片段的吸附作用有着明显的差异。目标micro RNA与单链DNA探针杂交形成DNA/RNA双链结构,双链特异性核酸酶可以识别DNA/RNA杂交双链,并且选择性地将双链中的DNA剪切成短寡核苷酸片段,从而引发双链特异性核酸酶信号放大反应。由于剪切得到的寡核苷酸片段较短,与二硫化钨纳米片之间的吸附作用较弱,从而产生很强的荧光信号,实现对micro RNA的高灵敏检测。本章发展的分析方法检测下限为300 f M,并且具有良好的选择性,能实现单碱基错配的良好区分。该方法为二硫化钨纳米片与核酸信号放大技术的结合提供了一个实例,在生物医学研究和临床诊断领域具有很大的应用潜力。
[Abstract]:In recent years , the method has the advantages of simple operation , high sensitivity , high response speed , low detection cost and so on . The method has the advantages of simple operation , high sensitivity , high response speed and low detection cost . This method is simple , high in sensitivity and good in selectivity . It is expected to provide a low - cost , high - sensitive homogeneous analysis and detection platform for UDG activity analysis and related biological research . This paper presents a novel fluorescence analysis method for high sensitive detection of micro RNA , which can be used as a fluorescent dye quencher .
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TP212.3;TB383.1

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