基于金纳米棒的多功能复合材料在口腔癌诊断与治疗中的应用

发布时间：2018-08-04 13:12

【摘要】：口腔癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,占全身恶性肿瘤的5%-6%,5年生存率仅为50%。由于口腔癌解剖位置特殊,常累及口腔颌面部重要的器官和组织结构,对于该肿瘤的治疗提出了更高的要求。口腔癌的早期诊断可有效提高肿瘤患者的5年生存率及生活质量,然而,目前的诊断技术手段灵敏度及特异性较低,不仅费时且通常依赖昂贵的诊断设备。因此,开发具有高灵敏度、高特异性、省时、经济的新型诊断技术手段是口腔癌诊断过程中需要迫切解决的问题。目前,口腔癌的主要治疗手段是以手术治疗为主的,包括化学治疗、放射治疗在内的综合序列治疗,然而,传统治疗方式在治疗口腔癌的同时往往为患者带来严重的毒副作用以及颌面部容貌缺陷,导致患者沉重的社会心理负担,影响患者的生活质量。因此,也亟待开发一种治疗效果可靠,局部损伤较小的新型治疗方式。金纳米棒(GNRs)作为一种新兴的纳米材料,其独特的表面等离子共振效应(SPR)使其被广泛用于生物感知、生物成像、药物运载及光热治疗等生物医学领域。同时,金纳米棒具有合成简便、表面功能化技术手段丰富、生物相容性好等优点,通过表面多功能化修饰,可以将金纳米棒与其他诊断、治疗方式相结合,达到诊疗一体化或联合治疗的目的。金纳米棒由于其优异的光学及物理特性,目前已被广泛用于肿瘤的诊断及治疗研究。本研究将通过对金纳米棒进行表面修饰,链接特异性口腔癌染色剂孟加拉红(RB)制备纳米复合体分别用于口腔癌的高灵敏诊断和快速筛查,同时利用其光动力和光热特性进行口腔癌的联合治疗；此外,我们还探究将金纳米棒作为基因治疗载体用于光热治疗增敏的研究。第一部分基于金纳米棒的多功能复合纳米材料的制备及其表征检测目的：金纳米棒作为多功能纳米材料的优势在于其丰富的表面功能化选择。在本部分研究中,我们采用可特异性与口腔癌细胞结合的染色剂-孟加拉红(RB)对金纳米棒进行表面修饰,制备孟加拉红-金纳米棒纳米复合体(RB-GNRs),用于后续口腔癌诊断及治疗；同时,利用静电结合方式制备金纳米棒-siRNA复合体用于口腔癌光热-基因联合治疗。方法：利用晶种介导的方式合成十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)包被的原始金纳米棒,并采用逐层包被的方式将聚(烯丙胺盐酸盐)(PAH)包被于金纳米棒表面形成PAH-GNRs复合体,利用静电结合的方式链接孟加拉红与PAH-GNRs,从而得到孟加拉红-金纳米棒纳米复合体(RB-GNRs) 。利用紫外-可见-近红外分光光度计、Zeta电势仪及透射电镜检测合成过程中金纳米棒的吸收光谱、表面电势及形态特征。利用静电结合方式制备GNRs-siRNA复合体,检测其Zeta电势、光热转换性能以及形态特征,并通过琼脂糖凝胶电泳检测GNRs与siRNA最佳复合比例。最后,采用MTT法检测上述合成的金纳米棒复合体的细胞毒性。结果：利用上述方法合成孟加拉红-金纳米棒纳米复合体,通过紫外-可见-近红外分光光度计检测该复合体吸收光谱显示RB-GNRs复合体同时具有RB和GNRs的特异性吸收峰,提示形成稳定复合体；Zeta电势检测结果显示在GNRs表面修饰过程中可见其表面电荷的变化,进一步证实RB分子成功结合至GNRs表面；透射电镜结果则显示RB-GNRs的长宽径分别为52±4 nm,13±2 nm,比值为4.2,提示该复合体可能具有良好的细胞摄入能力。利用静电结合的方式将siRNA和GNRs复合,由于siRNA带有负电荷,Zeta电势检测结果可见GNRs表面电势的翻转,同时复合体的纵向等离子共振波峰轻微红移,均提示siRNA结合至GNRs表面；透射电镜显示GNRs-siRNA相比于GNRs差异较小。利用琼脂糖凝胶电泳检测GNRs的siRNA最大复合能力,结果显示制备的GNRs的siRNA最大复合能力为24ug/pM (siRNA:GNRs)。最后,利用MTT法检测上述复合体的生物相容性,显示在低浓度下,均无明显细胞毒性。结论：成功合成具有水溶稳定性好、细胞毒性小、且具备较强近红外光学吸收的RB-GNRs复合体以及GNRs-siRNA复合体,并可满足后续口腔癌诊断及治疗的研究。光热转换性能以及形态特征,并通过琼脂糖凝胶电泳检测GNRs与siRNA最佳复合比例。最后,采用MTT法检测上述合成的金纳米棒复合体的细胞毒性。第二部分孟加拉红-金纳米棒纳米复合体在口腔癌诊断中的应用目的：以第一部分合成的孟加拉红-金纳米棒复合体(RB-GNRs)为诊断平台,利用孟加拉红特异性结合口腔癌细胞后导致的金纳米棒表面等离子共振(SPR)波峰位移及其在近红外光吸收的变化实现口腔癌的高灵敏诊断和快速筛查。方法：通过反复冻融的方式获得口腔癌细胞系Cal-27和正常口腔上皮细胞裂解液,将其加入RB-GNRs溶液中,利用紫外-可见-近红外分光光度计检测混合液中RB-GNRs的表面纵向等离子体共振(LSPR)波峰位移,明确RB-GNRs与Cal-27中内容物的特异性结合,实现口腔癌的高灵敏度感知；通过将RB-GNRs与培养中的口腔癌细胞Cal-27孵育2小时后,去除上清中RB-GNRs,基于口腔癌细胞对RB-GNRs的特异性摄取,利用自制的近红外检测成像系统检测口腔癌细胞中RB-GNRs对于近红外光的吸收强弱,通过计算形成热图,实现口腔癌的多通道检测。结果：基于口腔癌细胞裂解液中RB-GNRs的表面等离子体共振感应实验结果显示,与口腔癌细胞Cal-27细胞裂解液孵育后,RB-GNRs的LSPR波峰发生明显红移；且2.2×103至30.3×103个细胞/mL的浓度范围内,RB-GNRs的LSPR波峰红移的幅度与细胞数呈线性正相关,检测极限可达2000个细胞/mL,显示出极高敏感性。与正常上皮细胞裂解液孵育后,未见RB-GNRs的LSPR波峰发生明显红移,上述结果显示RB-GNRs对口腔癌细胞具有高度特异性。口腔癌细胞的近红外吸收成像分析实验结果显示,将终浓度为0.45nM的RB-GNRs加入96孔板中,与口腔癌细胞及正常上皮细胞孵育2小时后,口腔癌细胞Cal-27细胞对于近红外吸收明显高于正常上皮细胞,且吸收强度与细胞数量呈线性正相关。结论：RB-GNRs可作为口腔癌特异性感应探针,对口腔癌细胞裂解液进行高灵敏度诊断；同时,利用自制的近红外吸收成像捕捉RB-GNRs被口腔癌细胞摄取导致的近红外吸收,并进行成像分析,可以对口腔癌细胞进行多通道快速检测。本部分研究为口腔癌诊断提供了新型的无创、简便的诊断方法。红移的幅度与细胞数呈线性正相关,检测极限可达2000个细胞/mL,显示出极高敏感性。与正常上皮细胞裂解液孵育后,未见RB-GNRs的LSPR波峰发生明显红移,上述结果显示RB-GNRs对口腔癌细胞具有高度特异性。口腔癌细胞的近红外吸收成像分析实验结果显示,将终浓度为0.45nM的RB-GNRs加入96孔板中,与口腔癌细胞及正常上皮细胞孵育2小时后,口腔癌细胞Cal-27细胞对于近红外吸收明显高于正常上皮细胞,且吸收强度与细胞数量呈线性正相关。第三部分孟加拉红-金纳米棒纳米复合体介导的光动力-光热联合治疗口腔癌目的：孟加拉红(RB)作为一种经典的光敏剂,在532nm激光照射下,可产生活性氧发挥光动力治疗效应;而金纳米棒(GNRs)在近红外光照射下则具有极强的光热转换效率,可发挥光热治疗效应；基于以上两点,我们推测复合体RB-GNRs可能在复合光照的情况下同时发挥光动力与光热治疗效应,达到联合治疗口腔癌的目的。方法：通过自制装置检测RB-GNRs在810nnm近红外激光照射下的光热转换效率；利用9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)分解实验检测RB-GNRs在532nm激光下通过产生活性氧形成促进ABDA的分解速率；分别证实RB-GNRs的光热及光动力治疗效应。通过MTT、Annexin V/PI双染试验检测RB-GNRs在532nm光照射下对口腔癌细胞Cal-27的细胞毒效应及凋亡诱导能力；同时,采用流式细胞术检测处理后的口腔癌细胞中ROS的生成,证明RB-GNRs在532nm光照下于口腔癌细胞中产生单氧的能力。通过台盼蓝染色及MTT检测RB-GNRs在810nnm激光照射下对口腔癌细胞的细胞毒性,利用二甲基苯并蒽(DMBA)诱导的金黄地鼠颊癌模型,通过近红外热成像技术,验证RB-GNRs在810nm光照下的产热效率。在金黄地鼠颊癌动物模型中,验证RB-GNRs在复合光照下对于肿瘤的治疗效果和作用机制。结果：利用自制光热检测装置发现RB-GNRs在经810nm激光照射后14分钟可明显提升溶液温度,显示RB-GNRs具有良好的光热转换能力；ABDA分解实验证实RB-GNRs在经532nm激光照射后可显著促进ABDA的分解,结果显示经照射12分钟后92%的ABDA发生分解,提示RB-GNRs具有极强的活性氧生成能力；MTT及Annexin V/PI双染检测显示RB-GNRs在532nm照射下可显示出明显的细胞毒性和细胞凋亡诱导能力,同时,利用二氢二氯荧光素(DCFH)氧化后荧光反应检测532nm激光激发下RB-GNRs促活性氧簇(ROS)生成能力,显示绿光照射后RB-GNRs可在短时间内显著增加细胞内ROS含量。台盼蓝染色及MTT结果显示RB-GNRs在810nm激光照射可产生明显的细胞毒性。在金黄地鼠颊癌模型中瘤内注射RB-GNRs,进行810nm激光照射后,热成像检测显示肿瘤局部温度显著升高,提示RB-GNRs在近红外激光下良好的光热转换效率。最后,通过建立金黄地鼠颊癌模型进一步在体内水平上证实了RB-GNRs在复合光照下的良好的抗肿瘤效果。结论：RB-GNRs在532nm激光照射下具有良好的光动力效应,而810nm激光照射下可发挥优越的光热转换效能。RB-GNRs在复合光照即532nm和810nm激光照射下可发挥良好的光动力及光热治疗效应,在金黄地鼠颊癌模型有效抑制肿瘤生长,甚至治愈肿瘤；在口腔癌治疗中展示出巨大的临床应用前景。明显的细胞毒性和细胞凋亡诱导能力,同时,利用二氢二氯荧光素(DCFH)氧化后荧光反应检测532nm激光激发下RB-GNRs促活性氧簇(ROS)生成能力,显示绿光照射后RB-GNRs可在短时间内显著增加细胞内ROS含量。台盼蓝染色及MTT结果显示RB-GNRs在810nm激光照射可产生明显的细胞毒性。在金黄地鼠颊癌模型中瘤内注射RB-GNRs,进行810nm激光照射后,热成像检测显示肿瘤局部温度显著升高,提示RB-GNRs在近红外激光下良好的光热转换效率。最后,通过建立金黄地鼠颊癌模型进一步在体内水平上证实了RB-GNRs在复合光照下的良好的抗肿瘤效果。第四部分金纳米棒-BAG3 siRNA纳米复合体介导的口腔癌光热治疗增敏目的：为进一步提高金纳米棒光热治疗效果,消除肿瘤细胞在光热治疗过程中产生的热抵抗,我们拟采用静电吸附siRNA的方式,合成GNRs-BAG3 siRNA复合物,利用GNRs作为光热剂及siRNA载体沉默热抵抗相关基因-BAG3,增强肿瘤细胞对于GNRs介导的光热治疗的敏感性,以光热-基因联合治疗的方式,提升GNRs介导的肿瘤光热治疗效果。方法：利用实时定量PCR及western blots的方法检测口腔癌细胞Cal-27在经GNRs介导的光热治疗后的热休克相关蛋白的表达；利用荧光显微镜及流式细胞术检测口腔癌细胞Cal-27对GNRs-siRNAFAM复合体的摄取,并利用实时定量PCR及western blots测定GNRs-BAG3 siRNA对光热治疗后Cal-27细胞中BAG3的沉默效率。利用MTT.Annexin V/PI凋亡双染试验,以及检测Cleaved caspase-3的蛋白表达明确GNRs-BAG3 siRNA介导的光热治疗在口腔癌细胞中的效果。建立Cal-27裸鼠移植瘤模型,将GNRs-siRNAFAM注射于肿瘤组织后,利用荧光显微镜明确GNRs-siRNAFAM在体内肿瘤组织中的摄取。最后,利用裸鼠移植瘤模型验证GNRs-BAG3 siRNA介导的光热治疗治疗口腔癌的有效性；运用免疫组织化学、TUNEL染色技术检测肿瘤组织中的BAG3的表达及光热治疗后的细胞凋亡比例。结果：实时定量PCR和Western blots检测结果显示GNRs介导的光热治疗可诱导肿瘤细胞表达热休克相关蛋白HSP27、HSP60、HSP70、HSP90和BAG3表达。利用GNRs-siRNAFAM检测GNRs的运载能力,显示GNRs可成功将siRNA运载至口腔癌细胞Cal-27；同时,实时定量PCR和Western blots检测结果显示GNRs-BAG3 siRNA可有效抑制光热治疗中BAG3的表达升高。MTT及AnnexinV/PI凋亡双染结果显示GNR-BAG3 siRNA介导的细胞毒性及细胞凋亡明显高于单纯GNRs。通过建立Cal-27裸鼠移植瘤模型,在体内水平分别证实了GNRs-siRNA的分布和肿瘤细胞摄取,并证实GNRs-BAG3 siRNA优于单纯GNRs的治疗效果,并通过免疫组织化学和TUNEL检测发现GNRs-BAG3 siRNA在显著抑制BAG3的表达升高同时,促进细胞凋亡。结论：GNRs-BAG3 siRNA复合物通过利用GNRs的运载能力实现光热-基因联合治疗,通过抑制热休克反应相关蛋白BAG3的表达升高,提高口腔癌细胞对于光热治疗的敏感性,在降低光照激发强度的条件下,提升GNRs介导的光热治疗效果。至口腔癌细胞Cal-27；同时,实时定量PCR和Western blots检测结果显示GNRs-BAG3 siRNA可有效抑制光热治疗中BAG3的表达升高。MTT及AnnexinV/PI凋亡双染结果显示GNR-BAG3 siRNA介导的细胞毒性及细胞凋亡明显高于单纯GNRs。通过建立Cal-27裸鼠移植瘤模型,在体内水平分别证实了GNRs-siRNA的分布和肿瘤细胞摄取,并证实GNRs-BAG3 siRNA优于单纯GNRs的治疗效果,并通过免疫组织化学和TUNEL检测发现GNRs-BAG3 siRNA在显著抑制BAG3的表达升高同时,促进细胞凋亡。基于金纳米棒的肿瘤诊断与治疗具有广阔的临床应用前景,本实验深入探究了基于金纳米棒的多功能纳米复合材料在口腔癌诊断与治疗中的应用。在口腔癌诊断方面,通过制备孟加拉红-金纳米棒纳米复合体,利用其独特的表面等离子共振效应和近红外吸收效应实现了口腔癌的高灵敏诊断和多通道筛查；在口腔癌治疗方面,利用孟加拉红—金纳米棒在复合光照下的光动力和光热治疗效应,实现对口腔癌的联合治疗,同时,进一步制备金纳米棒-siRNA纳米复合体通过基因治疗的方式抑制肿瘤细胞的热抵抗效应,提升金纳米棒介导的光热治疗效果。总而言之,本研究论文阐述了利用金纳米棒作为诊断和治疗一体化载体的优越特性,及其在口腔癌诊断与治疗中的广阔应用前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TB383.1;O614.123

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