【摘要】：肿瘤是生长于靶器官却与其不相协调的组织团块的异常增生,恶性肿瘤由于其细胞可侵犯、浸润邻近组织细胞,并能通过血液或淋巴系统从原发部位转移到其他组织形成新的瘤块的特点,导致其难以治愈。传统的治疗手段均存在对机体损伤大、风险高、易于复发的问题,而基因治疗由于其独特的切入点为癌症的根治带来了希望。基因治疗是从分子层面入手,通过特殊传递系统将目的基因递送至靶细胞,而目前基因治疗的瓶颈则是寻求合适有效的基因载体系统。相较于免疫原性高、制备复杂的病毒载体,非病毒载体由于其细胞毒性低、易于制备、无感染和恶化风险等优势受到研究者的青睐,其中阳离子聚合物聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI),由于其独特的“质子海绵效应”和良好的转染效率,近年来研究较多。但PEI单独使用时存在体液稳定性差、高转染效率与低细胞毒性不相兼得、无肿瘤特异靶向性等问题。由此,本课题组尝试以细胞毒性低的支链型PEI 2kDa为骨架,用天然高分子材料壳聚糖进行结构修饰,构建PEI衍生物,以期在降低细胞毒性、增加生物相容性的同时确保高的转染效率;再连接双功能肽t Lyp-1—NLS(命名为K12),增加聚合物肿瘤细胞靶向性,进一步提高载体转染效率。本文第一章介绍了聚乙烯亚胺、壳聚糖单独作为转基因载体的应用及缺陷,说明先对壳聚糖进行改性再对聚乙烯亚胺进行修饰的必要性;短肽t Lyp-1能与肿瘤新生血管及细胞膜上高表达的NRPs受体特异结合,NLS是核定位信号肽,可促进细胞核递送,进一步靶向于细胞亚结构,依此提出设想,尝试构建新型双功能肽,再将其连接聚乙烯亚胺衍生物上,以期构建转染效率高、细胞毒性低、有肿瘤细胞靶向性的新型转基因载体。第二章讲述了本课题设想的新型转基因载体的具体构建方法:首先通过硼氢化钾、N-甲基吡咯烷酮等对壳聚糖进行改性,构建季铵化壳聚糖OTMCS,再通过N-羟基琥珀酰亚胺将其连接到支链型PEI 2kDa上,通过固相法合成双功能肽K12,最后通过SMCC法将前体PEI衍生物与K12连接,构建载体OTMCS-PEI-K12,并通过控制K12的投料比,构建低、中、高功能肽比例的聚合物,分别命名为OTMCS-PEI-K12-2,OTMCS-PEI-K12-5,OTMCS-PEI-K12-10。通过质谱、HPLC、1H-NMR对聚合物的合成情况进行表征,发现目的产物被成功合成,可用于后续实验。第三章通过体外实验,考察不同K12投料比的OTMCS-PEI-K12的理化性质:通过酸碱滴定实验发现,经过OTMCS和K12修饰的PEI,缓冲能力有所减弱,但相较于生理盐水,仍表现出良好的缓冲效果;通过琼脂糖电泳实验考察OTMCS-PEI-K12包合DNA能力,发现2、5、10倍K12投料比的OTMCS-PEI-K12分别能在w/w为0.8,1.2,1.6时将DNA完全缩合,且可以抵抗至少50 U DNase I/μg DNA和200μg/mL的肝素钠的解离;通过扫描电镜发现,聚合物OTMCS-PEI-K12单体呈现枝桠蓬松状,结合DNA后,复合物OTMCS-PEI-K12/DNA呈结构紧密的椭圆形,且纳米粒子分散系均一、稳定,通过粒度-电位仪检测,发现在复合物质量比为5—30之间时,OTMCS-PEI-K12/DNA粒径约为100—600nm,Zeta电位约为1—36m V;通过MTT、水解实验考察OTMCS-PEI-K12的细胞毒性,结果显示,即使在高浓度下,OTMCS-PEI-K12仍表现出低的细胞毒性低,且能在60h后水解为小分子,有良好的生物降解性。第四章通过体外细胞实验,考察了OTMCS-PEI-K12的转染能力,并通过在细胞系中添加不同抑制剂,初步探究聚合物的胞内运转机制:选用B16和U87细胞系,以绿色荧光蛋白pEGFP-N2和虫荧光素酶pGL3-Control为报告基因,选用PEI 25kDa作为阳性对照,结果显示,PEI 2kDa转染效率明显低于PEI 25kDa,但随着OTMCS、K12的逐步修饰,聚合物转染效率逐渐增强,在相同质量比下,新合成的载体OTMCS-PEI-K12转染效果好于PEI 25kDa;OTMCS-PEI-K12在不同细胞系中转染效果不同,其在U87中的转染效果明显优于B16;不同K12投料比的OTMCS-PEI-K12在U87中转染效果有所差异,相同条件下,OTMCS-PEI-K12-5转染效果最好。通过在细胞系中添加微管、微丝、Dynein抑制剂考察胞内转运情况发现:微管的动态平衡对OTMCS-PEI-K12影响不大,而当胞内微丝、Dynein受到抑制时,OTMCS-PEI-K12的转染受到抑制,且随抑制剂浓度增大,转染效率降低,说明OTMCS-PEI-K12是受体介导的特异性胞内转运,适宜机体中非分裂分化细胞的转染。第五章在前期研究基础上,选择体外转染效果最好的OTMCS-PEI-K12-5作为载体,以ING4为治疗基因,通过构建U87无胸腺小鼠肿瘤模型,采用尾注、瘤注两种给药方式,考察不同质量比载药复合物OPK5/DNA的肿瘤组织靶向性及治疗能力。结果表明,通过尾静脉给药且复合物OPK5/DNA在w/w=12时,目的基因诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长的效果最好,说明OPK5有U87肿瘤细胞靶向性能。综上,本课题成功构建新型阳离子聚合物OTMCS-PEI-K12,理化试验和体内、外转染结果表明,OTMCS-PEI-K12可兼得低的细胞毒性和高的转染效率,拥有良好的生物相容性、U87肿瘤细胞靶向性和体液稳定性,适宜作为转基因材料。
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【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.5;TB383.1
【参考文献】
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2245731
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