新型功能化二维二硫化钼纳米材料的制备及其在蛋白质组中的应用研究

发布时间：2020-03-30 05:30

【摘要】：在“自下而上”的蛋白质组学策略中,将蛋白质酶切生成更小片段的肽段无疑是基于高效液相色谱分离与质谱联用蛋白质组分析方法中最主要和最关键的步骤之一。然而,传统的蛋白质溶液酶切法通常存在耗时长、酶切不完全及酶自切污染等诸多不足,阻碍着蛋白质组高效、高通量和深度分析。另外,蛋白质的磷酸化修饰和糖基化修饰是两种最为常见和重要的蛋白质翻译后修饰。由于磷酸化肽段和糖基化肽段的低丰度、低离子化效率以及质谱分析时大量非磷酸化肽段或非糖基化肽段的干扰,使磷酸化蛋白质组和糖基化蛋白质组分析面临巨大挑战。针对以上问题,通过对具有不同特点材料的功能化修饰开发新型固定化酶反应器、翻译后修饰蛋白/肽段的特异性富集方法,可有效解决蛋白质组及翻译后修饰蛋白质组高效、高通量及深度覆盖问题,为蛋白质组功能研究奠定基础。基于此,本文围绕功能化超薄二维二硫化钼纳米材料的制备及其在蛋白质组研究中的应用,开展了以下工作:新型固定化酶反应器的制备及其应用:通过非共价键疏水堆积作用首先将1-芘丁酸(pyrene-1-butyric acid,1-PBA)固定于磁性二硫化钼片层表面,然后以共价键合方式结合胰蛋白酶制备出新型固定化酶反应器(Trypsin-PBA@Fe3O4@Mo S2),并将其应用于蛋白质组快速酶切,实现对蛋白质组快速分析。由于超薄二维二硫化钼纳米材料的高比表面积而负载了大量的胰蛋白酶,因而减低了酶与底物之间的空间位阻并有效改善了纳米级材料存在的团聚现象。实验结果说明新型固定化酶反应器具有高效性、稳定性及可重复利用的优点。同时,由于表面负载磁性纳米颗粒,使其能从反应体系中快速分离与回收。这种新型固定化酶反应器能在5分钟内高效地进行对BSA的酶切(氨基酸序列覆盖率高达84%),而传统的溶液酶切需要消耗12小时且只有74%的氨基酸序列覆盖率率。进一步将该新型固定化酶反应器应用于He La细胞和长柄扁桃(Amygdalus Pedunculata Pall.)种仁蛋白提取物的蛋白质组分析,实验结果表明使用该新型固定化酶反应器能在1小时酶切处理时间内达到比传统溶液酶切处理12小时更好的效果。通过对长柄扁桃种仁蛋白质组的功能分析,揭示了长柄扁桃在严峻沙漠化环境中能够良好生长可能的机制。新型固定化酶反应器的成功应用表明其在复杂生物蛋白质组研究中具有很大潜力。新型高选择性富集磷酸化肽段纳米材料的制备及应用:迄今为止,虽然已有多种具有不同亲和能力和选择性的磷酸化蛋白/磷酸肽富集材料被开发用于磷酸化蛋白质组研究中,然而,多数富集材料的制备方法繁琐复杂,有待进一步改进。二硫化钼是一种具有超薄二维平面结构的高比表面积材料,其特点是表面的负电性强,在不需要任何额外涂层和螯合配体的前提下,可以直接固定大量的钛离子于超薄二维二硫化钼纳米材料的表面,制备出新型钛(IV)离子修饰二维二硫化钼纳米材料(Mo S2-Ti4+)。该材料对磷酸化肽段的负载量高达100μg mg-1,富集灵敏度为5 fmol(β-casein),选择性为1:100。将这种材料用于α-casein酶切产物中磷酸化肽段的富集分析,实验结果表明该材料对于低丰度磷酸化肽段的分离与鉴定有着良好的普适性。进一步将该功能化材料用于脱脂牛奶胰蛋白酶酶解产物中磷酸化肽段的富集和质谱鉴定,可鉴定到12条磷酸化肽段,显示出该材料在磷酸化蛋白质组分析中潜在的优势。新型高选择性富集糖基化肽段纳米材料的制备及应用:为了进一步提高对糖基化肽段富集的高效性,我们采用高比表面积的超薄二维二硫化钼纳米材料为基质,通过两次简单、稳定的'Au-S'键反应先负载金纳米颗粒,再与含巯基的L-半胱氨酸发生化学反应制备出新型功能纳米材料Mo S2/Au-NP-L-cysteine。实验结果表明该新型复合材料可分别从人免疫球蛋白G和辣根过氧化物酶酶解产物中富集鉴定到37条和22条糖基化肽段,同时具有超低的灵敏度(10 fmol)、超高的选择性(人免疫球蛋白G与牛血清白蛋白摩尔比为1:1250)、较大的负载量(120 mg g-1)、高回收率(93%)和稳定的制备重现性。将该纳米材料用于50μg He La细胞外泌体中糖基化蛋白质组分析,三次重复实验总计鉴定到源自851种糖基化蛋白的2502条糖基化肽段,说明该功能化纳米材料可用于糖基化蛋白质组分析和研究。
【图文】：

示意图,酶反应器,蛋白质酶,制备流程

西北大学博士学位论文 2.2.7 基因本体分析与信号通路分析对鉴定到的长柄扁桃种仁蛋白质组通过使用在线 David 6.8 软件（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）进行 GO（基因本体，Gene ontology）生物功能富集分析和 KEGG（京都基因与基因组百科全书，kyoto encyclopedia of genesand genomes）信号通路分析，GO 注释结果按生物过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）进行分类。GO 条目的 p-value 设定为≤ 0.01。2.3 结果与讨论2.3.1 新型固定化胰蛋白酶反应器的制备与表征

酶反应器,使用量,效率,固定化酶反应器

型固定化酶反应器 Trypsin-PBA@Fe3O4@MoS2的使用量对酶切效igure 2-4. The influence of loading dosage of Trypsin-PBA@ Fe3O4@Mo统的溶液酶切相比，固定化酶反应器酶切处理的最大特点之一缩短酶切处理所需时间。我们利用 0.1 mg 新型固定化酶反应器性溶液在 37 °C 下反应不同的酶切时间，考察了新型固定化酶反中的酶切时间的影响并进行优化。如图 2-5 所示，由新型固定效率随时间的变化结果可以看出，新型固定化酶反应器的酶切的增加而增高，当酶切时间大于 5 分钟后，，BSA 的氨基酸序恒定(84%、图 2-6b)。与溶液酶切相比，新型固定化酶反应器84%、图 2-6b 和表 2-1）明显优于传统的溶液酶切的酶解效率和表 2-2），并且将酶解时间由 12 小时缩短为 5 分钟，因此，后钟酶切时间。另外，新型固定化酶反应器可以使用磁铁快速、
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ136.12;TB383.1;Q51

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