碳量子点荧光探针的合成及其对生物体核酸结构的影像分析

发布时间：2020-05-16 18:39

【摘要】：核酸是最基本的生命物质之一,分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),在遗传信息的储存、复制、传递以及蛋白质的合成中发挥着重要作用。实时原位监测活细胞及生物体内DNA和RNA的分离、聚集和裂解等结构动态变化对理解核酸转录、蛋白表达、细胞凋亡等细胞行为和研究遗传性疾病具有重要意义。然而,由于目前的成像探针存在生物膜穿透能力弱、无法同步区分DNA和RNA、自身光稳定性差等局限性,在活细胞,尤其是生物体内,实时原位的观察DNA和RNA结构的动态变化仍然面临很大的挑战。碳量子点由于其细胞毒性小,光稳定性好,易于进行表面功能化修饰等特点,在细胞及活体原位影像分析中发挥了重要作用。本论文中,我们通过对碳量子点进行化学修饰,提高碳量子点表面的正电荷,得到了具有高效生物膜穿透能力的阳离子碳量子点探针(carbon quantum dot,cQD),实现了细胞及线虫体内DNA和RNA结构的同步原位荧光成像。本论文具体研究内容如下:(1)设计合成了一种具有高效生物膜穿透能力的阳离子cQD探针。首先,通过硝酸氧化剥离导电炭黑颗粒得到了尺寸均一的含羧基碳量子点。进一步,通过对苯二胺修饰,得到了绿色荧光碳量子点。最后,将4-羧丁基三苯基溴化膦通过对苯二胺的氨基连接到碳量子点上,得到带正电的cQD探针。cQD探针与规则双螺旋的dsDNA和柔性折叠的ssRNA具有不同的结合方式,从而实现对二者的光谱区分。(2)实现了cQD探针对活细胞内DNA和RNA的同步原位成像与动态影像分析。合成的阳离子cQD探针能够有效的穿过细胞膜/细胞核膜,与细胞内的DNA和RNA结合,在488 nm激发下,细胞核发出很强的绿色荧光,而在543nm激发下,细胞质和核仁发出红色荧光,证明了cQD探针对活细胞内DNA和RNA的特异性识别能力。进一步,由于该探针强的光稳定性和低毒性,实现了对细胞有丝分裂过程中DNA和RNA结构动态变化的影像分析,并且通过STED超高分辨成像,实现了对染色体和核仁结构的3D重构。(3)最后,我们探讨了该cQD探针对活的线虫体内DNA和RNA的原位成像分析。将cQD探针加入到秀丽隐杆线虫的培养液中,我们发现,cQD不仅进入线虫的肠道,而且继续穿过肠道壁、性腺壁等一系列组织器官,最终进入线虫性腺内,与生殖细胞DNA和RNA结合,与细胞结果类似,在488 nm和543 nm激光激发下分别发出绿色和红色荧光。这一结果证实了cQDs在体内跟踪DNA和RNA的能力,更重要的是证明了其穿过肠道壁、组织间质、性腺囊壁、生殖细胞膜/细胞核膜等组织细胞水平膜屏障的高效生物膜穿透能力。
【图文】：

单分子荧光,探针

目标物特异性响应的识别位点及随着目标物含量变化产生颜色响应的母体分部分组成，从而实现对目标分子检测的荧光信号输出。分子荧光探针设计简单，类多，响应动力学快，灵敏度高，在荧光分析检测中具有广泛的应用。以荧类、罗丹明类、香豆素类、花菁类等传统有机染料分子为母体，，来设计引入标分子特异性响应的活性反应位点，是目前合成分子探针的一种主要方法［３ＭＱ］们课题组在荧光分子探针的合成及成像应用方面也做了一些工作［３６，３７］。一是光素分子为母体，在水合肼作用下，使荧光素分子中生成一个新的五元杂环，逡逑坏了荧光素母体分子中的共辄结构，关掉了荧光素的荧光，同时为了增加探子的溶解性和生物相容性，在探针分子中引入了三乙二醇侧链，设计合成了对羟基自由基（？0！！）和次氯酸（ＨＣ１０）同时响应的单分子荧光探针ＦＨＺ邋（．１）邋［３６］。二是在香豆素母体分子上引入含两个氮的侧链来增加探针分子的水溶生物相容性，同时引入能与硫化氢分子（Ｈ２Ｓ）特异性响应的二硝基苯醚的侧链，计合成了对Ｈ２Ｓ特异性响应的分子探针。而且由于引入的Ｍ７Ｖ－二甲基乙二胺使得探针分子在水溶液中带有微弱的正电荷，使得该探针可以自由渗透过细和细胞核膜，分布于整个细胞内［３７］。逡逑

标记技术,多循环,多色,单分子

利用这一性质，人们构建了基于氧化石墨烯的焚光“关－开”的焚光传感平逡逑台，并成功实现了邋ＤＮＡ，蛋白质、疾病信号分子等检测％＂６５：１。＼＾＾等［６６］首次实现逡逑了氧化石墨烯在生物检测中的应用。如图１．４所示，修饰有染料分子的单链ＤＮＡ逡逑（ｓｓＤＮＡ）单独存在在溶液中时，由于染料分子的存在，此时溶液体系发出很强逡逑５逡逑
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q52;O657.3;TB383.1

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