极端微生物耐辐射奇球菌合成功能性纳米金颗粒的机制及其特性研究

发布时间：2020-06-02 18:55

【摘要】：纳米金颗粒(gold nanoparticles,AuNPs)是金的任一维度介于 1 nm 至100 nm之间的微细颗粒,具有独特的理化性质,在生物传感、纳米医学等领域应用广泛。微生物合成纳米金的方法具有经济、安全、环保等优势,备受研究人员的关注。然而,其合成机制和功能尚缺乏深入的研究;而且,在极端环境下大部分微生物不能很好地存活及合成纳米金。极端微生物-耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,简称Dr)胞内抗逆成分资源丰富,对辐射、高氧化等极端环境具有显著抗性。因此,研究耐辐射奇球菌在高效合成纳米材料中的作用机制及功能特性具有重要意义。本研究采用生物化学、纳米材料学、分子生物学、细胞生物学、转录组学等方法,研究了耐辐射奇球菌吸附还原Au(Ⅲ)离子并生物合成功能性纳米金颗粒的能力、过程及形成的纳米材料的功能特性,揭示了耐辐射奇球菌生物合成功能性纳米金颗粒的分子机制及颗粒功能的作用机理。主要结果如下:1.发现耐辐射奇球菌具有较强的Au(Ⅲ)离子耐受能力,胞内外均可高效还原Au(Ⅲ)并合成纳米金颗粒(Dr-AuNPs);而且,菌体细胞合成AuNPs的速率也相对高于大肠杆菌等细菌。合成的Dr-AuNPs主要呈球形,Zeta电位为-20.01+0.17 mV,其分布在菌体的胞内、胞质及胞外。研究表明,Au(Ⅲ)是通过与菌体生物分子上的羧基、羟基、胺和含磷基团的结合,先后被还原至Au(Ⅰ)及Au(0),进而在上述基团的包被作用下形成稳定的Dr-AuNPs。Dr-AuNPs能够通过损伤金黄色葡萄球菌等细菌的外被而表现出抑菌活性,但对人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、正常大鼠肾细胞NRK均无明显毒性;Dr-AuNPs可以用作抑菌剂。2.鉴定了包被在Dr-AuNPs表面的蛋白质,发现菌体蛋白质参与形成功能性AuNPs。利用菌体蛋白质介导合成的纳米金(Drp-AuNPs)呈球形,粒径为51.72±7.38nm,其表现出较好的稳定性。Au(Ⅲ)与菌体蛋白质的羟基、羧基、胺、巯基和含磷基团发生相互作用后,其被还原至Au(Ⅰ)及Au(0),Au(0)再被进一步包被形成稳定的Drp-AuNPs。研究发现,菌体细胞抗氧化体系中的蛋白质CrtI和Dps2表现出不同的合成AuNPs的能力,这可能与蛋白质的氨基酸组成及其本身的还原能力相关。与常用的柠檬酸钠-纳米金(SC-AuNPs)相比,Drp-AuNPs表面有蛋白质的包被,因而颗粒稳定性较好、无明显细胞毒性,在生物传感、药物载体等领域具有一定的应用潜力。3.发现耐辐射奇球菌胞内的特种四萜类化合物-耐辐射奇球菌素(Deinoxanthin,DX)能够高效合成由DX氧化产物功能化的DX-AuNPs,并阐明了其合成机制。DX是通过其环和碳链上羟基的脱氢作用提供电子,迅速还原Au(Ⅲ)至Au(Ⅰ),然后进一步还原Au(Ⅰ)至Au(0)并在DX3(去质子化的2-ketodeinoxanthin)的包被作用下形成稳定的DX-AuNPs。合成的DX-AuNPs呈球形,电动电势为-24.95±0.38mV。与SC-AuNPs相比,DX-AuNPs对乳腺癌细胞MCF-7及肾癌细胞ACHN有更为显著的抑制作用,但对正常细胞NRK并未表现出明显的毒性。DX-AuNPs能够积累在MCF-7的细胞质、细胞器和细胞核中,在细胞内诱导自噬、活性氧产生、DNA损伤等作用,进而导致肿瘤细胞凋亡。转录组测序表明,DX-AuNPs显著影响(上调或下调)MCF-7细胞的基因表达水平,DX-AuNPs的诱导肿瘤细胞凋亡功能可能主要归因于DX-AuNPs对细胞内生长代谢、氧化应激、自噬、细胞凋亡等相关基因表达的影响。本研究表明,极端微生物-耐辐射奇球菌菌体细胞、蛋白质、特种代谢产物(四萜)等都可以还原转化Au(Ⅲ)离子,形成具有不同活性基团包被的功能性纳米金。研究结果揭示了耐辐射奇球菌中参与AuNPs合成的生物活性分子及其功能基团,阐释了耐辐射奇球菌生物合成功能化AuNPs的机制及其功能特性,为生物合成功能性纳米材料提供了基础和原料,同时为深入阐述生物合成金属纳米材料的机制和功能化修饰纳米材料提供了新的借鉴和参考。此外,研究结果也将为耐辐射奇球菌合成的功能性AuNPs等纳米材料在生物、医学等领域的应用提供支持。
【图文】：

色变,表面等离子体共振效应,学位论文,分子识别

学位论文逦１建立原子核模型［３，１５］。而于１８５７年Ｍｉｃｈａｅｌ邋Ｆａｒａｄａｙ首次发现的ＡｕＮＰｓ与常见的本体Ａｕ相比，ＡｕＮＰｓ的导带和价带是分更为新奇的理化性质：具有生物惰性、表面等离子体共振效应、子与分子识别特性等，而且溶液颜色随着尺寸的改变而变化（种生物大分子结合而作为一种多功能纳米材料［８，１６］。不仅如此，容易通过大小、形状或结构的调整而改变，但它的基本元素组。逡逑

表面形貌,细胞毒性,包被剂,物理化学参数

大部分的研究发现，，ＡｕＮＰｓ是无毒、生物相容的［１９，２Ｇ］；然而，也有一小部分逡逑研究表明在某些实验条件下，ＡｕＮＰｓ会展现出一定的负面效应［２１］。ＡｕＮＰｓ的细逡逑胞毒性评估过程、方法如图１．２所示，其细胞毒性评估结果主要受到以下实验因逡逑素的影响［２２］：邋ｌ）ＡｕＮＰｓ的类型；２）起稳定作用的表面涂层剂；３）纳米颗粒（ＮＰｓ）逡逑的物理化学参数（直径、表面电荷、表面形貌及表面积）；４）处理条件（时间和浓度）；逡逑５）实验细胞类型；６）试验类型（体内或体外试验）；７）ＮＰｓ对试验测读的干扰。一逡逑般而言，ＡｕＮＰｓ的细胞毒性主要受表面包被剂的影响，表面有生物包被基团、带逡逑负电荷的ＡｕＮＰｓ基本无细胞毒性［２３］。逡逑｜ｉ￥Ｒ２２Ｓ邋Ｆａｂｎｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ逡逑！逦Ｓｉｚｅ，邋ｓｈａｐｅ，邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，邋ｃｈａｒｇｅ邋（Ｃ）逡逑ＴＥＭ．邋ＳＥＭ．邋ＤＬＳ，邋ＵＶ－ｖｉｓ．邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ邋＾逡逑＂逦ｉ逡逑：逦Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，邋ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ逡逑｜逦Ｇ逦ＰＥＧ－ＳＨ邋ＰＥＯ－ＳＨ邋ＢＳＰ逡逑■逦ＴＮＦ－ａ，邋Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．邋Ｆｏｌａｔｅ．．逡逑０１＾＾邋Ｍｏｄｅｌ邋（ｍｉｃｅ，邋ｒａｔｓ，邋ＨｅＬａ邋ｃｅｌｌｓ．．）逡逑芯邋Ｒｏｕｔｅｓ邋ｏｆ邋ｅｘｐｏｓｕｒｅ邋ＩＶ邋ＩＰ邋ＲＥ，邋ＧＡ逡逑丨……——邋ｐ＼逦］逦＂Ｎ逡逑Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ａｕ邋ｔ逦Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，逦￣逡逑Ｋｉｎｅｔｉｃｓ邋ｏｆ逦＿逦Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ逦％邋ｍ邋ｔ逡逑ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TB383.1;Q93

【参考文献】