应答型杂化纳米给药系统用于肿瘤诊疗的研究

发布时间：2020-08-08 05:17

【摘要】：癌症已成为严重影响和危害人类生命健康的重要疾病。权威数据显示,2015年我国癌症新增病例430万例,死亡281万例。更有临床证据表明,超过60%以上的癌症患者,在癌症确诊时,癌细胞早已发生了转移扩散。目前,虽然化疗作为癌症治疗的主要方式之一,广泛应用于治疗各种癌症,但仍面临抗癌药物在体内非特异性分布及无法及时有效监控治疗效果等一系列问题。因而,如何早期诊断和提高癌症治疗效率显得尤为重要。目前,传统的诊疗方法主要存在两大挑战:1、能否进行精确的前期诊断及检测;2、如何精确追踪治疗效果以实现精准化治疗。纳米技术为癌症治疗带来了诊疗一体化的新概念,即利用纳米载体共包载诊断和治疗分子来达到对癌症病灶处的精确定位和准确清除。纳米材料将癌症的诊断和治疗有机地结合在一起,可实时监测纳米药物对癌症的治疗效果。核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)作为一种非常重要的诊断方式,通常需要造影剂的辅助来提高诊断信息的准确率。由于MRI信号的强度与造影剂的浓度有着密切关系,因此为了增强肿瘤组织与正常组织的信号对比度,就需要造影剂在肿瘤部位的高效富集。纳米造影剂的应用可实现这一目的,因为粒径小于200 nm的纳米粒子可通过“高通透性和滞留效应”(Enhanced Permeability and Retention,EPR)聚集在肿瘤组织,增加影像技术的信号灵敏度和空间分辨力,从而实现早发现早治疗的目的。同时,纳米载药体系除通过EPR效应被动靶向于癌症部位之外,还能通过靶向修饰实现抗癌药物的主动靶向,从而进一步提高抗癌药物在癌细胞内的富集。其次,纳米粒子还具表面反应活性高、活性中心多、吸附能力强等特点,这些特性都为实现整合药物靶向运输、活体示踪、药物治疗和预后监测等功能于一体提供了可能。鉴于“诊疗一体化”体系对于癌症治疗的重要意义,科学研究者设计了多种癌症治疗造影剂与药物分子的共递送系统。据报道双亲性嵌段共聚物可作为抗癌药物的共价连接载体,同时物理包裹氧化铁等纳米颗粒,设计出多功能的纳米复合体系,该体系具有MRI成像能力并能够及时追踪癌症的治疗情况为靶向性治疗提供成像引导,在成像的同时实现了对肿瘤的靶向治疗。但是,诊疗一体化纳米粒子的设计仍存在一系列挑战,一方面,通过传统的物理包载制备的纳米载体,载药量通常都较低(5%,w/w),且很难调控诊断剂与药物之间的比例。造成该结果的根本原因是:1、用于药物包载的纳米载体空间有限;2、药物分子与载体之间的非特异性的作用力(如:疏水性相互作用,氢键,范德华力和静电相互作用)较弱,导致药物在包载的过程中发生聚集并沉淀下来。目前为实现诊疗纳米载体高效载药的研究还比较少,有研究者曾开发出紫杉醇-纳米晶体,将荧光成像剂巧妙地植入到晶格结构中,但是该晶格结构只能用于高疏水性的小分子物质的包载,另外基于该种载体的溶出释放机理,导致药物释放缓慢从而延迟了诊疗效果的发挥。另一方面,纳米级颗粒由于其特殊的粒径,会大量聚集在网状内皮系统,尤其是聚集在肝脏内的Kupffer细胞中,这样就会使肿瘤组织中的信号受到属于网状内皮系统的器官的信号干扰,造成误诊。因此,使用具有靶向性纳米粒子作为造影剂/药物递送载体,能避免来自网状内皮系统的信号干扰,提高癌症诊断和治疗的有效性。目前,已有一些具有靶向性的MRI探针被开发出来,例如pH敏感的MnO纳米粒子或掺杂了Mn~(2+)的SiO_2纳米粒。但在这些依靠Mn~(2+)释放来实现pH响应的MRI探针的材料结构内,Mn~(2+)通常处于一种稳定的配位环境,因此Mn~(2+)的释放速率很慢。由于这一缺陷,病人需要在做检测前注射高剂量的造影剂,并等待更长的时间以保证足够量的Mn~(2+)在肿瘤内富集,这会给病人造成不必要的身心伤害。另外,纳米材料本身的毒副作用也会阻碍它们的临床应用。因此,制备一种高载药量、刺激响应型、高生物相容性的多功能纳米材料有望实现“诊疗一体化”的目的。脂质磷酸钙纳米载体(LCP)是一种pH响应型纳米载药系统,广泛应用于药物及显影剂递送。该纳米载体由无机磷酸钙内核与外层非对称性的脂质双分子层构成,通常通过油包水的微乳体系制备而成。该纳米粒子可以通过细胞的吞噬作用进入肿瘤细胞内,在内涵体与溶酶体的酸性条件下崩解,将包载的药物释放出来。科学研究表明脂质磷酸钙纳米载体可用于蛋白类物质、基因(如:DNA或siRNA)及亲水性小分子药物(如:吉西他滨)的递送。另外也有研究证明该体系可以包载放射性核素用于单光子发射成像系统。据相关文献报道锰离子可通过共沉淀的方法包载到脂质磷酸钙的内核实现核磁共振成像。同时,该纳米载体也可同时包载疾病治疗剂与诊断剂,形成多功能的诊疗纳米粒子。据统计,大部分的原料药都为脂溶性的小分子物质,但脂质磷酸钙纳米载体存在的一个极大缺陷为不能有效递送疏水性药物。因此,如何将疏水性药物高效包载到脂质磷酸钙的内核及外层,目前已成为科学研究的一大挑战。在磷酸钙内核的制备过程中,通常钙离子的投料量会远远超过磷酸根离子的投料量,这就使体系中带负电的磷脂通过静电吸附作用很好的稳定在内层。由于生物体质膜的基本结构也是脂质双分子层,LCP外层脂质具有与生物体细胞相类似的结构,因此有很好的生物相容性。磷脂作为细胞膜的主要组成部分具有广泛的应用性与良好的生物相容性,必然成为纳米诊疗载体的一个最为有利的候选因素。在脂质磷酸钙纳米载体结构的启发下,我们假设,具有极大比表面积的磷酸锰纳米载体也可以作为锚定界面通过静电作用吸附带负电荷的药物分子实现药物分子的高效率包载,并且该纳米粒子同时具有pH敏感的刺激响应释放特性。根据生命体内及其病灶部位的不同的pH环境进行靶向治疗,从而提高药物治疗效果。许多药物分子均具有可离子化基团(例如磷酸基,羧酸基)或可修饰的活性官能团,通过化学修饰使其带有一定的电负性,然后包载到磷酸锰纳米粒子上,这就意味着该方法可以广泛应用于各类药物的递送系统。利用外层磷脂DOTAP作为抗肿瘤药物的稳定剂,将肿瘤治疗剂高效地包载在外层磷脂中间层,并利用聚乙二醇作为外层修饰剂,实现该诊疗纳米粒子在肿瘤部位的快速积累,并延长血液循环时间。基于上述假设,本课题通过将疏水性模型药物喜树碱进行化学修饰,使其末端带有磷酸根基团,此磷酸根基团可以通过静电作用吸附到磷酸锰内核,而另一端的疏水性药物喜树碱则可以通过疏水相互作用与最外层的磷脂形成稳定的脂质双层结构。同时,核磁共振成像的显影剂锰离子也可以被部分钙离子代替,实现诊断剂与治疗剂的合理调控,使该纳米粒子同时具备肿瘤诊断与治疗的能力,即pH应答“诊疗一体化”纳米粒子。一方面,喜树碱的末端修饰,增强了该药物的稳定性,使静电作用载药成为可能,有利于高效载药这一目标的实现;另一方面,该脂质磷酸锰纳米粒子在人体血液中性pH条件下,纳米粒子的脂质外层结构稳定,能实现诊疗纳米粒子在肿瘤部位的快速积累与释放,并延长药物的血液循环时间,防止药物提前释放,降低药物的毒副作用;在癌细胞内部内涵体/溶酶体酸性条件下,磷酸锰内核崩解,纳米粒子内部的锰离子及磷酸根离子解体,增大了内涵体中的渗透压,使内涵体/溶酶体因渗透压差溶胀破裂,喜树碱和Mn~(2+)离子外逃,有望实现实时、精确诊断病情并同步进行治疗的目的。本课题首先利用疏水性抗肿瘤药物喜树碱末端的羧基活性基团,通过酯化反应在喜树碱羧基末端连接带有磷酸根的小分子物质,形成了带有磷酸根的喜树碱磷酸衍生物。并通过质谱(MS),核磁共振波谱(~1H NMR)、(~(31)P NMR),红外光谱(IR)进行结构确认,以证明两种喜树碱磷酸衍生物的成功合成。该物质的成功合成,一方面,增强了喜树碱药物的稳定性;另一方面,也为静电相互作用载药提供了可能,有利于达到高效载药的目的。本课题通过探究不同投料比喜树碱磷酸衍生物/磷脂(DOPA)制备的纳米粒子发现,无论是双磷酸衍生物组还是单磷酸衍生物组,随着磷酸衍生物投入比的增加,载药量依次增加。同时,双磷酸衍生物由于具有双磷酸基团,对磷酸锰内核的吸附作用更强,因此载药量更高,当双磷酸衍生物完全替代内层的脂质(DOPA)时,载药量高达16.9±3.0%(w/w)。本实验进一步探究了不同投料比的双磷酸衍生物的粒径及血清稳定性,结果发现随着双磷酸衍生物投入比例的增加,制备的纳米粒子的粒径逐渐增大,我们推测是由于喜树碱磷酸衍生物与内层脂质(DOPA)对磷酸锰内核的排列或堆积方式不同造成的,也可能是由于喜树碱磷酸衍生物及内层脂质与外层脂质的疏水相互作用不同造成的。当DOPA完全被双磷酸衍生物完全替代时,所制备纳米粒子的粒径为118.7±5.7 nm,可以满足肿瘤被动靶向EPR效应所需要的纳米粒径。本实验利用喜树碱的荧光特性研究了该纳米载体的血清稳定性,当喜树碱包裹在磷酸锰纳米粒子的内层时,由于堆积作用会导致喜树碱荧光淬灭,当喜树碱药物从纳米粒子内层中逐渐释放出来时,喜树碱的荧光会逐渐增强。实验结果发现,所有的荧光变化曲线在1 h后接近稳定,进一步说明了该纳米载体良好的血清稳定性。因此本实验选择具有最高载药量,具有良好生物稳定性的纳米载体进行后续的药物释放及细胞动物实验。本课题通过探究脂质磷酸锰纳米载体在模拟人体环境不同pH条件下的药物释放实验,证明喜树碱磷酸衍生物及内核锰离子均为pH刺激响应型释放模式。由于磷酸根是多元酸,具有三级解离常数(pKa_1=2.1,pKa_2=7.2,pKa_3=12.7),在pH 7.4的中性环境下(pHpKa_2),主要以HPO_4~(2-)的形式存在,有利于其与Mn~(2+)静电结合形成磷酸锰纳米粒子;在酸性条件下(pHpKa_2),主要以H_2PO_4~-的形式存在,降低了其与Mn~(2+)的静电相互作用,导致磷酸锰纳米载体的逐渐崩解,释放药物与显影剂。研究不同pH条件下该纳米载体的体外弛豫效率发现,该纳米载体具有超强的核磁共振T_1成像性能,在酸性条件下(pH 5.0),该纳米载体的弛豫效率达到25.2 mM~-11 s~(-1)。该研究结果表明随着酸性逐渐增强,Mn~(2+)离子释放量逐渐增加,且释放出的锰离子能迅速与外周组织蛋白结合增强成像对比度。本课题的细胞毒性和细胞摄取实验表明,该磷酸锰纳米粒子能够有效递送喜树碱到达4T1肿瘤细胞内,IC_(50)为5.4±0.3μM。动物实验证明,该磷酸锰纳米粒子的血液相容性系数为0.7±0.2%,表明该纳米具有良好的血液相容性。小鼠的核磁共振成像实验表明,该磷酸锰纳米粒子较游离氯化锰,能够实现在肿瘤部位的快速积累,有望达到准确报告疾病位置,疾病形态及疾病对治疗的反应状态这一诊断目标。生物分布及肿瘤治疗实验进一步表明,该脂质磷酸锰纳米粒子能将药物准确高效地递送到肿瘤部位,且对机体的心、肝、脾、肺、肾没有明显的伤害作用,该纳米载体在4T1肿瘤小鼠中显示出显著的抗肿瘤功效。本课题利用静电相互作用将抗肿瘤药物高效包载到刺激响应型磷酸锰内核外层上,实现了抗肿瘤药物与显像剂的高效递送和合理调控,为诊疗纳米粒子的制备提供了新的方法,该研究必将为癌症诊疗带来新的希望。通过优化选择脂质磷酸锰纳米载体,构建了稳定、高效和安全的纳米递送系统。该纳米载体充分利用抗癌药物和高准确度的癌症诊断显影剂的有机结合,为有效提高药物呈递效率和减轻药物毒副作用,高效精确诊断肿瘤及实时监控治疗效果提供新的契机,有利于推动该领域的基础研究和广泛应用。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R73-3;TB383.1

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