肝癌是在我国仍是一种常见的恶性肿瘤,并且具有较高的死亡率。肝动脉化疗栓塞术(Transarterial chemotherapy and embolization,TACE)是治疗BCLC中期肝癌的一线治疗手段。通过肝动脉插管造影,并且灌注的碘油栓塞肿瘤血供及化疗药物杀伤肿瘤细胞以控制肿瘤的进展。但TACE治疗肝癌的效果目前仍不能令人满意,在TACE中使用的化疗药物对于患者的生存期及肿瘤反应的作用存在争议。多项临床对照实验表明,TACE的治疗肝癌的效果与单纯栓塞(Transhepatic Arterial Embolization,TAE)相比无明显差异。在TACE中使用的化疗药物在肿瘤组织内分布不佳是导致其抗肿瘤效果不能令人满意的主要原因之一。随着纳米医学的发展,由于纳米材料的表面可修饰性为药物的靶向递送带来了广阔的研究前景,装载化疗药物的靶向基团修饰纳米材料改善了抗肿瘤药物在肿瘤组织内的摄取及分布,并增强了药物的抗肿瘤效果。因此,基于以上存在问题及研究基础,本研究以中空介孔纳米二氧化锆(ZrO_2)为载体,利用纳米ZrO_2的中空结构装载化疗药物阿霉素(DOX),以环状RGD肽(iRGD)为靶向修饰分子,制备具有肿瘤主动靶向功能的ZrO_2纳米药物递送系统(R-DZCNs),并探讨其在肝癌TACE治疗中的效果。研究方法:1.以纳米二氧化硅球为模板,通过刻蚀法合成中空介孔结构纳米ZrO_2。通过真空负压法在纳米ZrO_2的中空结构中装载阿霉素。以EDC.NHS反应在ZrO_2纳米材料的表面修饰肿瘤靶向肽iRGD。利用透射电镜(TEM),动态光散射粒度仪(DLS),ZETA电位仪对合成的R-DZCNs的形态结构,粒径分布,和表面电位进行分析。并对R-DZCNs材料中阿霉素在体外的释放情况进行评估。2.将载阿霉素的非靶向二氧化锆纳米药物(DZCNs),靶向纳米药物(R-DZCNs)与HepG2肝癌细胞共同孵育,通过CCK-8法检测ZrO_2纳米材料及R-DZCNs对细胞的毒性作用及增殖抑制作用。并通过共聚焦显微镜观察R-DZCNs及DZCNs中阿霉素的荧光在细胞内的分布,比较它们在体外对HepG2肝癌细胞靶向性。3.动物实验:分为阿霉素药物肿瘤组织内分布实验及抗肿瘤效果实验。通过经皮穿刺种植法建立兔VX2肝脏肿瘤模型,并利用MRI扫描监测VX2肿瘤的生长情况。在DSA的引导下行兔肝动脉插管,进行肝动脉造影及药物灌注。在阿霉素组织中分布的研究中,分为DOX+Lipiodol组,DZCNs+Lipiodol组及RDZCNSs+Lipiodol组。在各组中分别经肝动脉给与碘油及阿霉素或DOZCs或R-DZCNs。在给药10分钟及4小时后,处死取瘤,通过免疫荧光对肿瘤血管染色,计算肿瘤内的阿霉素荧光点数及阿霉素组织穿透距离,从而评价阿霉素在VX2瘤内的摄取及分布情况。在抗肿瘤效果的研究中,将荷瘤兔分为对照组,DOX+Lipiodol组,DZCNs+Lipiodol组及R-DZCNSs+Lipiodol组。在对照组中经肝动脉给予生理盐水作为对照,另外三组分别经肝动脉给予碘油及阿霉素或DZCNs或R-DZCNs。在治疗后7天及14天分别通过磁共振扫描,监测各组中肿瘤体积的变化情况。在最后一次扫描结束后,处死取瘤,通过免疫组化及蛋白印迹法监测各组肿瘤组织内凋亡相关因子(Caspase-3,Bax,Bcl-2)的表达。并对重要脏器(心、肝、脾、肾、肺)行HE染色观察,评估R-DZCNs的安全性。结果:1.合成的iRGD靶向纳米药物体系R-DZCNs电镜下直径约为165.2±8.2 nm,纳米颗粒形状相对均一。其水合粒径约为230.1 nm,粒径分布具有良好的均一性和稳定性。当药物投入量与纳米比例为1:2时,药物装载率为20%,药物包封率为50%。R-DZCNs中阿霉素在模拟肿瘤酸性环境下(PH=5.5),其24小时内的释放率为37%。2.CCK-8结果显示单纯的ZrO_2纳米材料在100ug/m L至400ug/m L的浓度范围内对HepG2肝癌细胞均无明显增殖抑制作用,表现出良好的生物相容性。在DNZCs与R-DZCNs对HepG2增殖抑制的比较中,在各个浓度梯度上,R-DZCNs表现出了比非靶向载药纳米材料更好的HepG2细胞增殖抑制作用(P0.05)。3.通过对非靶向组和靶向组细胞内荧光强度进行分析,发现R-DZCNs组细胞内阿霉素荧光强度明显高于DZCNs组(159.52±23.76 vs 118.53±16.85,P=0.014)。4.在肿瘤内药物分布的研究中,在给予肝动脉灌注碘油及DOX/DZCNs/R-DZCNs 10分钟后,各组的阿霉素荧光点数未有明显的差异(1417.60±353.82 vs1407.11±520.58 vs 1585.59±484.10,P0.05)。而在灌注4小时后,DOX+Lipiodol组,DZCNs+Lipiodo组及R-DZCNs+Lipiodol组的荧光点数分别为2469.15±554.14,3604.73±632.75及4462.25±585.62。R-DZCNs组的荧光点数明显多于DOX+Lipiodol组DZCNs+Lipiodol(P0.05)。在给药后10分钟,DOX+Lipiodol组,DZCNs+Lipiodol组及R-DZCNs+Lipiodol组与血管的距分别为(33.75±7.3)mm,(27.36±8.13)mm及(34.78±10.04)mm,R-DZCNs与其他两组相比未见明显差异(P0.05)。阿霉素荧光点而在灌注4小时后,DOX+Lipiodol组,DZCNs+Lipiodol组及R-DZCNs+Lipiodol组阿霉素荧光点与血管的距离分别为58.64±14.53μm,83.37±13.76μm and 109.58±22.34μm,。R-DZCNs组的阿霉素荧光点与血管的距离明显多于DOX+Lipiodol组及DZCNs+Lipiodol组,(P0.05)。5.在体内抗肿瘤效果的研究中,介入治疗之前在对照组,DOX+Lipiodol组,DZCNs+Lipiodol组及R-DZCNs+Lipiodol组的VX2肿瘤体积分别为378.32±28.33mm3,352.89±38.85 mm3,416.1±44.29 mm,398.97±56.91 mm,(P0.05)。在治疗后7天对照组,DOX+Lipiodol组,DZCNs+Lipiodol组及R-DZCNs+Lipiodol组,肿瘤体积分别为(3349.58±313.15)mm3,(1151.26±277.65)mm3,(758.71±223.12)mm3,(578.01±313.16)mm3,R-DZCNs+Lipiodol组的体积明显低于对照组,DOX+Lipiodol组(P0.05),但与DNZCs+Lipiodol组无明显差异(P0.05)。治疗14天后,对照组,DOX+Lipiodol组,DZCNs+Lipiodol组及R-DZCNs+Lipiodol组中,体积分别为(8590.69±564.42)mm3,(3349.58±313.15)mm3,(2281.06±457.21)mm3,(1383.87±354.75)mm3,R-DZCNs+Lipiodol组的体积明显小于其他三组(P0.05)。免疫组化分析中,Caspase-3染色在DOX+Lipiolol组,DZCNs+Lipiolol组及R-DZCNs+Lipiolol组中Caspase-3的表达率分别为对照组的2.2,3.4倍及5.7倍,在R-DZCNs+Lipiolol组中的表达明显高于其他三组(P0.05)。而Bax分别为2倍,3.8倍及5.8倍,在R-DZCNs+Lipiolol组中的表达明显高于其他三组(P0.05)。在阿霉素组,DZCNs组及R-DZCNs组中Bcl-2的表达分别是对照组的0.7倍,0.48倍及0.22倍,在R-DZCNs+Lipiolol组中的表达明显低于其他三组(P0.05)。Western检测的Caspase-3,Bax及Bcl-2在各组表达比较:在DOX+Lipiodol组,DZCNs+Lipiodol组及R-DZCNs+Lipiodol组中Caspase-3的表达率分别为对照组的1.7倍2.6倍及4.3倍,R-DZCNs+Lipiolol组中的表达明高于其他三组(P0.05)。而Bax分别为1.9倍2.5倍及3.2倍,在R-DZCNs+Lipiolol组中的表达明显高于其他三组(P0.05)。在DOX组,DZCNs组及R-DZCNs组中Bcl-2的表达分别是对照组的0.8倍,0.6倍及0.3倍,在R-DZCNs+Lipiolol组中的表达明显低于其他三组(P0.05)。6.心脏,脾脏,肝脏,肺脏,肾脏的苏木精和伊红染色(HE染色)切片未观察到显着的组织损伤或炎症反应。结论:本研究成功合成了具有肿瘤细胞靶向功能的纳米药物系统R-DZCNs。在体外实验中,R-DZCNs表现出了对肿瘤细胞良好的主动靶向性,表现出了更好的肿瘤细胞增殖抑制。在体内实验中,将R-DZCNs应用在肝癌的介入治疗中,通过经肝动脉给予碘油及R-DZCNs,可明显增强阿霉素在肿瘤组织内的分布,增强了化疗药物在肝癌介入治疗中的抗肿瘤效果。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R735.7;TB383.1
【部分图文】：
3 结果3.1 中空介孔 ZrO2 的合成如图 3.1a 所示，纳米颗粒的尺寸及形态较为均一。通过粒径分布计算软件测量，合成的 ZrO2的粒径平均为 165nm。利用动态光散射法测量 ZrO2的流体力学直径为 209.nm，且粒径分布较窄，表明成功的合成了颗粒均一的 ZrO2纳米颗粒（图 3.1b）。ZETA 电位仪测得 ZrO2的电位为 -38.4mV（图 3.1c）。
电位-38mV.3.2 R-DZCNs 的的表征如图3.2a 所示，R-DZCNs的流体动力学直径分布特点与ZrO2纳米颗粒相似，为230.9n，分布范围较窄。在iRGD 表面修饰过程中，iRGD的羧基先被活化，再与ZrO2纳米表面上的氨基反应而形成酰胺键，从而连接在ZrO2的表面。ZrO2纳米初始ZETA电位为-38.2mV，在氨基化改性之后变为+24mV
103.3 盐酸阿霉素的装载与释放如图3.3.1所示，盐酸阿霉素标准曲线计算公式为y=9.9729x+0.0754（y=吸光度值，单位是A.U.；x=盐酸阿霉素的浓度，单位是ug.mL-1）。当盐酸阿霉素与ZrO2纳米材料的投入量为1:2时，阿霉素的包封率为50%，载药率约为25%。在1h，2h，3h
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本文编号：
2810387
