功能化复合纳米材料构建Signal-on光电化学生物传感器及其相关应用研究

发布时间：2020-10-01 19:35

　　随着全世界癌症患病率提升及晚期疾病诊断所致的死亡人数增多,生物传感器在精准医疗、临床诊断等领域扮演着越来越重要的作用。生物传感器是由生物感应元件和信号处理元件组建起来的一种分析检测平台,它具有灵敏度高、专一性强、操作简单、成本低廉等优势,主要涉及化学、生物学、医学、物理学、微电子学等学科,是在交叉学科的基础上发展起来的,目前已广泛应用到各个领域。其中,核酸和酶生物传感器因其灵敏度高、能耗少、易微型化等特点,逐渐成为生化分析等交叉领域的热点课题。核酸生物传感器主要依赖碱基互补配对原则实现对核酸分子等的分析检测,比如疾病基因和单碱基突变的检测及特异性核算序列分析。另外,利用序列特异性核酸与蛋白质、小分子等结合,可以实现对蛋白质、小分子等的检测。酶生物传感器是基于底物与酶之间特异性反应所产生的信号,从而实现对目标物的检测。然而,由于大多数酶属于蛋白质,需要在特定的温度、pH条件下才能保持其最佳的活性,且个别酶在发生作用时还需辅酶协助,因此酶生物传感器在构建过程中需注意实验条件的选择。由于此类核酸、酶生物传感器检测的目标物自身的特性,需结合复合纳米材料和信号放大策略,才可以实现对痕量或超痕量目标物的高灵敏检测,获得最优的分析检测性能。本文围绕光电化学生物传感器及相关研究的关键问题,如稳定且高活性的传感界面构筑、信号放大策略设计,从而实现高灵敏检测、可再生新型传感器搭建,利用功能化复合纳米材料并结合杂交链式反应、G-wire超级结构、双酶催化等信号放大技术制备了一系列新型生物传感器。本论文旨在开发构筑新的分析检测平台,并对其相应原理、性能等问题进行全面深入地探索,主要研究内容及结论如下:1.基于免金属催化点击化学反应构建光电化学核酸生物传感器的研究众所周知,光电转换效率与光生电子-空穴对复合速率密切相关。本章中,我们基于杂交链式反应结合免金属催化的点击化学反应设计的信号放大策略,构建了一种新的光电化学核酸传感平台实现对miRNA灵敏检测。首先,在目标物的引发下,具有炔基修饰的发夹DNA会在电极基底发生杂交链式反应,形成大量的DNA双螺旋结构。然后,将电子供体多巴胺组装到有叠氮基团修饰的DNA探针上,获得信号探针P_(DA)-N_3,信号探针P_(DA)-N_3可借助免金属催化的点击化学反应链接到电极基底,最终实现对miRNA-141的超灵敏检测,检出限为27 amol L~(-1)。该方法相对于传统方法而言,将电子供体直接链接在基底上,可以更高效地抑制光生电子空穴重组实现光电信号的高效输出。首次利用免金属催化点击化学反应引入电子供体,简化固定操作步骤,提高了电子供体利用率。结合四面体DNA探针,有序可控地实现信号放大策略最终达到对miRNA分析检测的目的。2.基于G-wire超级结构的信号增强型光电化学核酸生物传感器研究我们利用微乳法制备高效的光电活性材料PtNCs/Cu_3(PO_4)_2NSs并将其用于构建“signal on”光电化学传感平台实现对miRNA的精确定量分析。通过微乳法可合成形貌结构可控的Cu_3(PO_4)_2NSs,据电镜表征证实其呈超薄片层状,厚度仅为1.3 nm。凭借紫外光诱导还原方法,以Cu_3(PO_4)_2NSs作为载体,在其上原位生长PtNCs。我们利用成功制备的超薄片层状PtNCs/Cu_3(PO_4)_2NSs复合纳米材料充当光电极材料,用于光电极基底修饰。在光电化学测试过程中,该复合纳米材料展现出优良的光电化学活性。基于G-wire超级结构信号放大策略,在电极基底成功固载大量的乳酸氧化酶,利用其氧化还原反应于电极表面原位产生的电子供体H_2O_2,高效抑制光生电子空穴的重组,实现信号放大,最终达到超灵敏检测miRNA-141的目的。此外,利用该光电化学传感平台研究了miRNA-141在22Rv1和HeLa细胞中的表达情况。超薄片层状Pt/Cu_3(PO_4)_2作为一种优良的生物相容性材料,在光电化学中具有巨大的应用潜力。因此,这种传感方法可推广于光电化学检测痕量目标物的研究中。3.基于免标记off-on模式及G-wire信号放大策略构建光电化学核酸生物传感器的研究MiRNA是一类内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,能够参与动植物中转录后基因表达调控。因此,miRNA的准确定量对于疾病诊断、预后和治疗具有非常重要的意义。然而,因其在机体内的低含量,通常情况下难于对其进行精确测定。本章中,我们基于免标记off-on模式构建了光电化学生物传感平台用于miRNA的定量分析。具体而言,首先借助静电吸附作用使得带正电荷的金溶胶与固载在电极表面的DNA“桥型”构型结合,由于金溶胶的表面等离子体共振吸收,能够获得“signal-off”的光电流响应信号。然后,利用DNA“四通路”构型引入目标物,与此同时,在核酸内切酶Nb.BbvCI辅助下输出特征c-myc序列,实现G-wire超级结构信号放大策略的构建,最后获得“signal-on”光电流响应信号。通过自主设计目标物转换体系,将目标物的输入转换成信号放大结构构建单元的输出,实现了对目标物miRNA-141的超灵敏检测。该新颖的off-on信号转换模式对开发简便易行、快速灵敏的新型信号放大策略具有十分重要的意义。4.基于Pd-Au纳米线的信号增强型电致化学发光生物传感器用于乙酰胆碱脂酶的分析我们利用水热法成功制备了一维钯金纳米线(Pd-Au NWs),将其用作电极材料修饰在电极基底,再结合双生物标志物识别和双酶催化的原理构建了电致化学发光生物传感器,并将其用于乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的检测。相对于单一组分的纳米线而言,Pd-Au NWs不仅可以提供更大的比表面积用于AChE固定,而且能够展示出更优异的电催化活性和电子转移能力。通过对AChE抑制剂和活化剂的筛选,选出有机磷和肟类化合物分别充当其抑制剂和活化剂,以被抑制活性和再恢复活性的AChE作为双生物标志物。此外,在双酶体系AChE和胆碱氧化酶存在的条件下,硫代乙酰胆碱会在AChE水解作用下产生硫代胆碱,进而与胆碱氧化酶发生氧化还原反应原位生成H_2O_2。最终,基于原位产生的H_2O_2作为共反应试剂,构建了经典的鲁米诺-H_2O_2电致化学发光传感平台实现了“signal-on”检测乙酰胆碱酯酶活性的目的。乙酰胆碱酯酶的检出限为0.0083 U L~(-1)。此电致化学发光生物传感器为生化分析中蛋白质测定提供了新途径,具有良好的指导意义。5.基于双生物标志物原理构建电化学生物传感器实现灵敏检测乙酰胆碱酯酶通过水热法一步合成了长度约为20 nm的钯纳米棒(PdNR),并将其与功能化C_(60)材料(C_(60)-TOAB)进行复合,最终得到复合纳米材料PdNR/C_(60)-TOAB。由于此复合纳米材料在电化学测试过程中会出现一对特征的C_(60)/C~-_(60)氧化还原峰,且AChE水解会产生具有电催化活性的硫代胆碱,基于此我们利用电化学检测技术联合双生物标志物原理构建了电化学生物传感器。通过引入复合纳米材料作为修饰电极基底材料,降低了体系的氧化电位,促进了电极表面电子转移并为后续AChE的孵育提供了良好的固载平台,利于电信号的输出,从而确保此生物传感器的分析检测性能。该构建的生物传感器最终实现了对AChE及其抑制剂有机磷的灵敏检测。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TB383.1;TP212.3
【部分图文】：

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化学生物传感器构建过程示意图；（B）光电流产生和 miRNA 检测机A) Schematic diagram of the fabrication process of the photoelectroc the photocurrent generation mechanism and microRNA detection m

荧光共振能量转移,癌胚抗原,金纳米粒子,聚合物

加工、存储、销售等过程中的食品卫生，可通过食品检测技术对食品生产程中的各个环节进行监测从而降低疾病隐患。生物传感器在环境监测领域对监测环境及实时了解环境污染情况，从而评估环境危害性并指导治理方定具有极其重要的意义。生物传感器可实现对土壤中农药残留的监测；对生物耗氧量的检测；对空气中污染气体如 SO2、NO2等的分析；对环境中 Hg2+等重金属离子及多环芳烃等有机污染物的检测。例如，Ren 等[34]通过核酶 III 催化目标物 Hg2+的循环放大，与此同时，体系中释放出大量 c-myc 序 K+、Mg2+作用下可以形成 G-wire 超级结构。基于此，成功地构建了共振射适配体传感器并实现了对痕量 Hg2+的免标记检测（图 1.4），最终获得检出限为 2.0 nmol L-1。 Du 等[35]基于有机磷对乙酰胆碱酯Acetylcholinesterase，AChE）的抑制作用及酶的水解产物硫代胆碱（ATCl电活性的特点，采用电化学方法实现了对环境污染物有机磷农药的检测。感器在科学研究中的应用有力地推动了生物学的发展。Ray 等[36]应用生物对大量 RNA 结合蛋白及结合特异性进行了系统分析和快速筛选，为后续究节省了大量的时间，极大地减轻了相关科研工作者们的劳动强度。

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图 1.4 免标记共振瑞利散射适体传感器示意图[34]。ure 1.4 Schematic illustration of the design principle of the label-free RRS aptase传感检测技术的研究进展电化学检测技术

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