基于荧光铜纳米颗粒和金属有机框架的生物传感新方法

发布时间：2020-10-25 02:27

　　 生物传感技术是一门综合了化学、信息学、生命科学等多种知识的交叉新兴学科,因其具有成本低、选择特异性、在线分析等众多优点,近年被广泛应用于分析检测、医学诊断等领域。纳米材料具有小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应一系列独特性能,从而表现出异于常规材料的物理与化学性质,成为当下研究热点。纳米材料的出现及其优良性质为生物传感的技术研发开辟了一条新思路,二者巧妙结合,有力地推动了化学分析、生命医学与材料科学等多个领域的迅速发展。本论文基于荧光铜纳米颗粒(CuNPs)与金属有机框架材料(MOFs),构建了三种响应速度快、分析成本低的新型荧光生物传感器,成功实现了对钾离子(K~+)、人类免疫缺陷病毒(HIV)相关寡核苷酸序列、三磷酸腺苷(ATP)的有效检测。具体内容如下:(1)第2章,基于核酸适配体与其目标物钾离子之间的特异性识别,借助于核酸外切酶I(Exo I)和末端保护现象,通过荧光铜纳米颗粒(CuNPs)的荧光信号强弱,构建了一个免标记、高灵敏度的钾离子传感器。首先,设计了一条包含两部分的单链DNA(ssDNA),其3’端为K~+核酸适配体序列,5’端为荧光铜纳米颗粒的合成模板聚T序列(poly T)。当K~+与3’端核酸适配体相互识别时,会诱导其发生折叠进而形成G-四链体二级结构,该二级结构能有效阻止Exo I对ssDNA从3’到5’端的水解,使得5’端poly T得以保留并为CuNPs的合成提供有效模板,体系可测到CuNPs的特征发射波长。当没有K~+存在时,3’端K~+核酸适配体不会发生结构变化形成G-四链体,3’末端没有二级结构保护,Exo I会将ssDNA水解成单个或很小的寡核苷酸碎片,因5’端poly T的合成模板被水解而无法合成CuNPs,体系荧光信号很低。该方法检测限低,具有灵敏度高、特异性良好、低成本等优点,可潜在应用于实际样品检测。(2)第3章,基于多孔型金属有机框架材料(MOFs)对单、双链DNA的吸附力显著不同,设计了一个基于铜为金属中心、均苯三甲酸为配体的金属框架材料(Cu_3(BTC)_2)的新型荧光传感器,用于检测人类免疫缺陷病毒相关寡核苷酸序列,并探究了材料的降解性。由于π-π堆积,Cu_3(BTC)_2能特异性吸附ssDNA,并通过光诱导电子转移(PET)效应猝灭ssDNA上标记的FAM荧光基团。当存在目标序列时,ssDNA杂交形成双链DNA(dsDNA)时,Cu_3(BTC)_2对dsDNA吸附力较小,使得dsDNA与Cu_3(BTC)_2作用后不会附着在材料表面,FAM荧光信号不会被猝灭,基于此构建了一个可快速有效检测HIV相关寡核苷酸序列的荧光传感平台。实验过程中还探究了材料Cu_3(BTC)_2的可降解性,利用氨基酸中羧基、氨基和Cu~(2+)的强配位能力,一定尺寸的氨基酸可通过MOFs表面的孔道进入材料内部,充分破坏Cu_3(BTC)_2内金属原子与有机配体之间的配位作用,实现对材料的降解,使得原本被吸附在Cu_3(BTC)_2表面的ssDNA被释放出来,被猝灭的FAM再度恢复荧光信号。该发现为快速检测小尺寸氨基酸提供了潜在可能。(3)第4章,三磷酸腺苷(ATP)是生物体内重要的能量储存与转换物质,被称为能量传递的“分子货币”,同时也是S1核酸酶的抑制剂。基于ATP对S1核酸酶活性的抑制作用,结合S1核酸酶对ssDNA的特异性水解反应,我们利用CuNPs在602 nm处的荧光发射信号,发展了一种可特异性检测ATP的免标记荧光传感器。设计了一条由30个T碱基组成的ssDNA(T30),T30为CuNPs的有效合成模板,S1核酸酶会特异性水解ssDNA,使得CuNPs无法合成,体系荧光信号弱。当ATP存在,会抑制S1核酸酶活性,T30得以保留并为合成CuNPs提供模板,此时可检测到CuNPs的较强发射信号。体系荧光信号强度与ATP浓度呈正比关系,线性范围为0-0.2 mM。实验表明该方法可成功应用于特异性检测ATP,且无需荧光标记,DNA序列设计简单,成本较低。
【学位单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：TB383.1;TP212.3
【部分图文】：

免标记双波长发射的生物传感器比率型检测DNA的示意图

如图1.2 所示，设计了两条分子信标（MB），MB1 和 MB2 其末端均修饰了巯基，利用 Au-S 键将 MB 固定于金纳米颗粒（AuNP）表面，另一个末端则标记了荧光基团（MB1 标记的 Alexa Fluor 488，MB2 标记的 Cy3），此时两条分子信标保持发夹结构，末端荧光基团离 AuNP 很近，AuNP 紫外吸收带较宽

图 1.3 基于 CuNPs 检测肌动蛋白的荧光传感器[52]）小分子的检测Chen 等人[56]以 dsDNA-CuNPs 复合试剂为探针，结合 SYBR Green I 设计了检测 H2O2的方法，该方法还能延伸到其他物质检测，如胆固醇，辣根过氧化
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本文编号：2855319