基于聚苯胺纳米孔的DNA分析
发布时间：2021-04-07 19:13
固态纳米孔作为传感元件已被广泛应用于蛋白和核酸分析。然而,极低的捕获效率及较快的穿孔速率限制了固体纳米孔传感器的灵敏度和分辨率。本研究制备了一种聚苯胺导电聚合物修饰的固态纳米孔,探究了ssDNA和dsDNA在其中的穿孔行为。研究表明,聚苯胺涂层与DNA间的静电相互作用能显著地将ssDNA的穿孔速率降低至48.2μs/base;同时,通过采用LiCl作为电解质溶液,此聚苯胺纳米孔对ssDNA的捕获效率明显增加。进一步研究发现,基于阻塞电流幅度和穿孔时间的不同,聚苯胺纳米孔能够实现ssDNA与dsDNA的区分。研究结果表明,固态纳米孔的功能修饰能够有效调控DNA分子穿孔行为。制备的聚苯胺纳米孔有望作为一个单分子纳米器件应用于生物分子的分析和检测。
【文章来源】：分析化学. 2020,48(03)北大核心EISCICSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
(A)聚苯胺(PANI)纳米孔检测DNA穿孔过程的示意图,灰色部分为基底-单离子径迹聚碳酸酯膜(PC膜),绿色表示PANI涂层; (B)PANI的化学结构; (C)PC纳米孔刻蚀过程的电流-时间变化,插图为刻蚀电流为0～0.5 nA时的电流-时间曲线; (D)PC纳米孔修饰PANI前后,通道I-V曲线的对比,插图为放大后的PANI纳米孔的通道I-V曲线。实验条件: 1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl,pH= 7.0
采用未修饰且具有相似孔径大小的PC膜纳米孔开展了ssDNA穿孔实验,研究表明,在0.1 mol/L KCl溶液中, +900 mV 电压作用下, 未检测到ssDNA的穿孔信号(图2A)。这可能是由于ssDNA穿孔速率太快,超出了单通道仪器检测的分辨率。然而,将ssDNA加入到聚苯胺纳米孔的检测池中,可以看到明显的电流阻塞信号。修饰聚苯胺后的纳米孔基线波动较大,这可能是由于孔内壁聚苯胺涂层不均匀引起。对照实验结果表明,在ssDNA不存在时,或施加-900 mV电压,无电流阻塞信号产生,证明此信号确实是由ssDNA与聚苯胺纳米孔相互作用产生。图2B为ssDNA穿孔滞留时间柱状图,通过单指数拟合发现,其值为τoff=(1.14 ± 0.05) ms,因此ssDNA的平均穿孔速率约为48.2 μs/base。同其它纳米孔相比(DNA穿孔速率约1～20 μs/base)[17,25～28],DNA在聚苯胺纳米孔的穿孔速率减小2.4～48倍。这是由于带正电荷的聚苯胺与带负电荷的DNA存在着静电相互作用,延缓了DNA的穿孔时间。图2C为ssDNA阻塞电流的柱状图,符合高斯分布,其统计值ΔI= (7.01 ± 0.14) pA。为了验证聚苯胺对ssDNA存在着静电相互作用,进行了聚苯胺纳米孔对ssDNA的静态吸附实验。向缓冲液加入ssDNA(终浓度0.5 μmol/L),经10 h静态吸附后,对PANI纳米孔进行电化学I-V表征。如图2D所示,相比于未进行吸附实验的聚苯胺纳米孔,吸附DNA后的聚苯胺纳米孔在正电压下的电流值变小,而在负电压下电流值变大,并且吸附DNA后,PANI纳米孔几乎不具有整流效应。这是由于PANI纳米孔对DNA的静电吸附作用使得内部的电荷分布发生了变化,孔壁中原本带正电荷的PANI被吸附的DNA覆盖后,表面的电荷发生中和,导致孔壁的净电荷密度减小,因此纳米通道无明显的整流效应。通过研究不同电压下ssDNA的穿孔行为发现,穿孔时间随着电压的增加而逐渐减少,据此可推断ssDNA穿过了聚苯胺纳米孔(图2E)。电压依赖性实验发现,ssDNA的穿孔频率随电压的增加而接近线性增大,表明扩散控制的捕获过程起主导作用(图2F)。进一步的研究表明,在0.1 mol/L KCl溶液中,当施加电压V<700 mV, 几乎检测不到DNA的穿孔信号,这可能是因为ssDNA受到的电场力不足以克服聚苯胺对其的静电吸引力,难以使DNA从管壁内部脱附下来,并穿过纳米通道。另外一个可能的因素是由于低电压产生的电渗流较小,未能驱动ssDNA进入聚苯胺纳米孔,因而也未产生阻塞电流。在纳米孔DNA分析中,多采用KCl或NaCl作为电解质溶液,但其穿孔速率过快或穿孔几率过低的缺点影响了纳米孔单分子分析的灵敏度和分辨率。Kowalczyk等[25]研究发现,采用Li+作为ssDNA的抗衡离子,能够有效减小其所带电荷,增加其穿孔时间,分辨率至少提高10倍。最近,Hu等[29]研究表明,Li+可减少蛋白纳米孔对长链ssDNA的捕获能垒,使其穿孔几率增强了10.23倍。
在0.1 mol/L LiCl溶液中,向检测池cis端加入50 nmol/L ssDNA并施加+900 mV的电压后,单通道电流trace及特征阻塞信号如图3A所示。研究表明,相比于0.1 mol/L KCl溶液(τoff=(1.14 ± 0.05) ms),ssDNA在0.1 mol/L LiCl溶液中阻塞电流信号的平均滞留时间统计值(τoff=(1.55 ± 0.14) ms)是其的1.36倍(图3B)。当Li+浓度增加到1 mol/L和3 mol/L时,ssDNA穿孔时间分别增加了2.35倍和8.91倍,其统计值分别为(3.64 ± 0.16) ms和(13.82 ± 0.76) ms。这是因为相比于K+,Li+与ssDNA具有更强的键合作用[27],能有效降低ssDNA链上所带的负电荷,因此,在相同电压下,ssDNA在Li+溶液中受到较小的电泳力作用,导致其穿孔速率减慢。而且随着Li+浓度增加,ssDNA的表面会结合更多的电荷抗衡离子,导致受到的电场驱动力更小,因而穿孔时间更长。虽然DNA表面负电荷的减少使其受到聚苯胺静电作用减小,导致穿孔速率增加,但电场力的主导作用使得ssDNA的滞留时间延长。研究还发现,高浓度Li+能产生更大的ssDNA电流阻塞幅度。ssDNA在不同浓度LiCl中穿孔频率如图3D所示,在0.1 mol/L LiCl(+900 mV)中,ssDNA的穿孔频率为(83.25 ±2.69) s-1,是同浓度KCl溶液中的1.30倍((64.07± 0.05) s-1)。在纳米孔单分子分析中,电渗流(EOF)的大小影响分析物的穿孔频率,当EOF和EP的方向相同时,EOF越大,穿孔频率越大。而EOF的强度依赖于施加在纳米孔两端的电压、电解质的浓度、电解质的类型等因素。以往的研究表明,EOF在LiCl中的强度比在KCl中大[27,30]。因此,在本研究中,施加相同电压(+900 mV)时,ssDNA在0.1 mol/L LiCl中穿孔几率比在同浓度KCl中大。进一步的研究发现,随着Li+浓度增加,ssDNA的穿孔频率降低,这与文献[30]一致[30]。这可能是由于随着盐浓度增加,聚苯胺纳米孔内壁的正电荷受到的屏蔽效应增大,导致孔的离子选择性降低,进而使EOF降低。总之,采用LiCl作为电解质溶液可明显增加聚苯胺纳米孔对ssDNA的捕获率,同时增加ssDNA的穿孔时间。3.3 PANI纳米孔对dsDNA穿孔行为的研究
本文编号：3124031
【文章来源】：分析化学. 2020,48(03)北大核心EISCICSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
(A)聚苯胺(PANI)纳米孔检测DNA穿孔过程的示意图,灰色部分为基底-单离子径迹聚碳酸酯膜(PC膜),绿色表示PANI涂层; (B)PANI的化学结构; (C)PC纳米孔刻蚀过程的电流-时间变化,插图为刻蚀电流为0～0.5 nA时的电流-时间曲线; (D)PC纳米孔修饰PANI前后,通道I-V曲线的对比,插图为放大后的PANI纳米孔的通道I-V曲线。实验条件: 1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl,pH= 7.0
采用未修饰且具有相似孔径大小的PC膜纳米孔开展了ssDNA穿孔实验,研究表明,在0.1 mol/L KCl溶液中, +900 mV 电压作用下, 未检测到ssDNA的穿孔信号(图2A)。这可能是由于ssDNA穿孔速率太快,超出了单通道仪器检测的分辨率。然而,将ssDNA加入到聚苯胺纳米孔的检测池中,可以看到明显的电流阻塞信号。修饰聚苯胺后的纳米孔基线波动较大,这可能是由于孔内壁聚苯胺涂层不均匀引起。对照实验结果表明,在ssDNA不存在时,或施加-900 mV电压,无电流阻塞信号产生,证明此信号确实是由ssDNA与聚苯胺纳米孔相互作用产生。图2B为ssDNA穿孔滞留时间柱状图,通过单指数拟合发现,其值为τoff=(1.14 ± 0.05) ms,因此ssDNA的平均穿孔速率约为48.2 μs/base。同其它纳米孔相比(DNA穿孔速率约1～20 μs/base)[17,25～28],DNA在聚苯胺纳米孔的穿孔速率减小2.4～48倍。这是由于带正电荷的聚苯胺与带负电荷的DNA存在着静电相互作用,延缓了DNA的穿孔时间。图2C为ssDNA阻塞电流的柱状图,符合高斯分布,其统计值ΔI= (7.01 ± 0.14) pA。为了验证聚苯胺对ssDNA存在着静电相互作用,进行了聚苯胺纳米孔对ssDNA的静态吸附实验。向缓冲液加入ssDNA(终浓度0.5 μmol/L),经10 h静态吸附后,对PANI纳米孔进行电化学I-V表征。如图2D所示,相比于未进行吸附实验的聚苯胺纳米孔,吸附DNA后的聚苯胺纳米孔在正电压下的电流值变小,而在负电压下电流值变大,并且吸附DNA后,PANI纳米孔几乎不具有整流效应。这是由于PANI纳米孔对DNA的静电吸附作用使得内部的电荷分布发生了变化,孔壁中原本带正电荷的PANI被吸附的DNA覆盖后,表面的电荷发生中和,导致孔壁的净电荷密度减小,因此纳米通道无明显的整流效应。通过研究不同电压下ssDNA的穿孔行为发现,穿孔时间随着电压的增加而逐渐减少,据此可推断ssDNA穿过了聚苯胺纳米孔(图2E)。电压依赖性实验发现,ssDNA的穿孔频率随电压的增加而接近线性增大,表明扩散控制的捕获过程起主导作用(图2F)。进一步的研究表明,在0.1 mol/L KCl溶液中,当施加电压V<700 mV, 几乎检测不到DNA的穿孔信号,这可能是因为ssDNA受到的电场力不足以克服聚苯胺对其的静电吸引力,难以使DNA从管壁内部脱附下来,并穿过纳米通道。另外一个可能的因素是由于低电压产生的电渗流较小,未能驱动ssDNA进入聚苯胺纳米孔,因而也未产生阻塞电流。在纳米孔DNA分析中,多采用KCl或NaCl作为电解质溶液,但其穿孔速率过快或穿孔几率过低的缺点影响了纳米孔单分子分析的灵敏度和分辨率。Kowalczyk等[25]研究发现,采用Li+作为ssDNA的抗衡离子,能够有效减小其所带电荷,增加其穿孔时间,分辨率至少提高10倍。最近,Hu等[29]研究表明,Li+可减少蛋白纳米孔对长链ssDNA的捕获能垒,使其穿孔几率增强了10.23倍。
在0.1 mol/L LiCl溶液中,向检测池cis端加入50 nmol/L ssDNA并施加+900 mV的电压后,单通道电流trace及特征阻塞信号如图3A所示。研究表明,相比于0.1 mol/L KCl溶液(τoff=(1.14 ± 0.05) ms),ssDNA在0.1 mol/L LiCl溶液中阻塞电流信号的平均滞留时间统计值(τoff=(1.55 ± 0.14) ms)是其的1.36倍(图3B)。当Li+浓度增加到1 mol/L和3 mol/L时,ssDNA穿孔时间分别增加了2.35倍和8.91倍,其统计值分别为(3.64 ± 0.16) ms和(13.82 ± 0.76) ms。这是因为相比于K+,Li+与ssDNA具有更强的键合作用[27],能有效降低ssDNA链上所带的负电荷,因此,在相同电压下,ssDNA在Li+溶液中受到较小的电泳力作用,导致其穿孔速率减慢。而且随着Li+浓度增加,ssDNA的表面会结合更多的电荷抗衡离子,导致受到的电场驱动力更小,因而穿孔时间更长。虽然DNA表面负电荷的减少使其受到聚苯胺静电作用减小,导致穿孔速率增加,但电场力的主导作用使得ssDNA的滞留时间延长。研究还发现,高浓度Li+能产生更大的ssDNA电流阻塞幅度。ssDNA在不同浓度LiCl中穿孔频率如图3D所示,在0.1 mol/L LiCl(+900 mV)中,ssDNA的穿孔频率为(83.25 ±2.69) s-1,是同浓度KCl溶液中的1.30倍((64.07± 0.05) s-1)。在纳米孔单分子分析中,电渗流(EOF)的大小影响分析物的穿孔频率,当EOF和EP的方向相同时,EOF越大,穿孔频率越大。而EOF的强度依赖于施加在纳米孔两端的电压、电解质的浓度、电解质的类型等因素。以往的研究表明,EOF在LiCl中的强度比在KCl中大[27,30]。因此,在本研究中,施加相同电压(+900 mV)时,ssDNA在0.1 mol/L LiCl中穿孔几率比在同浓度KCl中大。进一步的研究发现,随着Li+浓度增加,ssDNA的穿孔频率降低,这与文献[30]一致[30]。这可能是由于随着盐浓度增加,聚苯胺纳米孔内壁的正电荷受到的屏蔽效应增大,导致孔的离子选择性降低,进而使EOF降低。总之,采用LiCl作为电解质溶液可明显增加聚苯胺纳米孔对ssDNA的捕获率,同时增加ssDNA的穿孔时间。3.3 PANI纳米孔对dsDNA穿孔行为的研究
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