TGase催化丝胶接枝氨基多糖及其复合膜材料制备
发布时间：2021-10-19 04:04
丝胶（Silk sericin,SS）是桑蚕丝中包裹丝素组分的外层蛋白,属于桑蚕丝脱胶加工的副产物,具有较高的反应活性、良好的低免疫原性和生物相容性。另一方面,由于丝胶水溶性较高,以其为原料加工的再生蛋白膜材料的成型稳定性不理想,表现为水相条件下溶失率较高,不同程度上限制了其在生物材料领域的应用。本文采用谷氨酰胺转氨酶（TGase）催化酰胺基转移反应,实现丝胶大分子间交联,旨在通过提升丝胶蛋白的分子量,改善丝胶基材料的结构稳定性;在此基础上,分别选取壳寡糖（Chitosan oligosaccharides,COS）和壳聚糖（Chitosan,CS）,考察TGase催化氨基多糖与丝胶蛋白的接枝和桥接交联效果,在降低丝胶蛋白材料水溶性的同时,赋予丝胶基再生材料一定的功能性,制备抗菌和抗氧化丝胶基复合膜材料。首先选用含谷氨酰胺（Q）和赖氨酸（K）的定制肽（GQGEGQG,p-Q;KKKK,p-K）,探究多肽对TGase催化丝胶分子间发生酰基转移反应的影响;借助SDS-PAGE、SEC色谱评价蛋白体系分子量变化;结合酶促反应体系释氨量、游离氨基含量测定,评价TGase酶催化丝胶交联效果。结果...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TGase催化蛋白分子间发生转酰胺反应的途径Fig.1-1.TheproposedreactionpathwayofTGase-catalyzedacyltransferreactionsbetweenprotein
江南大学硕士学位论文102.4测试方法2.4.1丝胶蛋白溶液浓度的测定把三个具有一定规格称量瓶，放入105℃烘箱中烘干致重量不在变化，质量分别记录为w1、w2、w3。然后，往称量瓶内分别滴加VmL丝胶蛋白溶液，再次置于烘箱烘干，质量记录为w1"、w2"、w3"。丝胶蛋白溶液的浓度c采用公式（2-1）计算，三次测试结果取平均值[60]。c=w-w′V×100%(2-1)2.4.2释放氨含量的测定采用靛酚蓝法检测TGase处理过程中释氨量[61]。以氨质量浓度为1~7μg/mL硫酸铵溶液作为标准液，浓度C为横坐标，637nm处吸光度Ai为纵坐标，绘制释氨量标准曲线：Ai=0.096C+0.022，R2=0.99907。图2-1不同浓度的硫酸铵溶液中氨态氮浓度的标准曲线Fig.2-1Standardcurveofammonianitrogenconcentrationindifferentconcentrationsofammoniumsulfatesolution2.4.3氨基含量分析通过使用茚三酮法测定溶液中氨基量的变化，该方法基于甘基酸可与茚三酮反应形成蓝紫色物质[62,63]。颜色深度与溶液中氨基的量成一定比例，测定其在568nm处的吸光度相对于氨基浓度的标准曲线：Y=0.2506X+0.0171，R2=0.99647，其中Y为568nm溶液吸光度，X为甘氨酸浓度（10-5g/mL）。
第二章实验材料、仪器和方法11图2-2甘氨酸中游离氨基浓度标准曲线Fig.2-2Standardcurveofthecontentofprimaryaminesinglycine2.4.4SDS-PAGE凝胶电泳采用SDS-PAGE分析TGase处理前后丝胶的分子量变化情况[64]。测试：首先将样品溶液与上样缓冲液（4×Laemmli:2-巯基乙醇=9:1）按体积比为3:1的比例混合后，煮沸10分钟。将电泳胶安装于蛋白质凝胶电泳仪中，取将适量样品上样到8%~16%电泳胶孔内，在150V下对样品进行分离。电泳完成后，取出凝胶于Bio-SafeTMCoomassieG-250Stain中浸染1h，随后将其放在去离子水中进行脱色30min。测试中使用10~170kDa的SDS-PAGE蛋白质标准物作为分子量标记物。2.4.5体积排阻色谱（SEC）WatersE2695高效液相色谱仪可用来测试不同条件下反应后丝胶溶液的分子量变化。丝胶溶液经0.22μm的滤膜过滤后置于液相瓶中等待测试，测试条件为：进样量为10μL，流速0.5mL/min，柱温25℃。采用0.3mol/L氯化钠和50mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）作为流动相，使用Ultrahydrogellinear色谱柱（Waters，USA），2998PDADetector紫外检测器检测样品溶液在214nm处的SEC曲线。2.4.6傅里叶变换红外光谱（FTIR）通过NicoletIS10红外光谱仪（ThermoNicolet，USA）检测不同丝胶冻干膜的结构变化。采用溴化钾压片法，将样品冻干膜与溴化钾混合均匀，进行研磨压片，然后扫描32次，收集2000至500cm-1范围内的相应光谱，分辨率为4cm-1。采用OmnicV6.2和origin软件经去卷积和曲线拟合等数学方法进一步处理后，得到各样品二级结构的变化[65]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]壳聚糖在组织工程的应用[J]. 于玛丽,李丽梅,郭家智,边立功,李庆. 中国高新科技. 2019(03)
[2]壳寡糖的制备及其在医学和农业生产中的应用[J]. 原旭冰,刘洪涛,杜昱光. 生物技术进展. 2018(06)
[3]丝胶蛋白纳米纤维的研究进展[J]. 张显华,冯向伟,刘凡,王力争. 辽宁丝绸. 2017(03)
[4]丝胶蛋白的结构、性能及生物医学应用[J]. 肖肖,陈昌盛,刘伟强,张业顺. 化学进展. 2017(05)
[5]蛋白水解物水解度测定方法的研究[J]. 罗艳华,王全杰,陈沛海,高翔. 皮革与化工. 2017(02)
[6]壳聚糖的改性研究进展及其应用[J]. 王浩. 成都纺织高等专科学校学报. 2017(01)
[7]微生物谷氨酰胺转氨酶的优势结构及构效特征研究进展[J]. 李轶,范大明,黄建联,张文海,李广,赵建新. 中国食品学报. 2015(07)
[8]溴酚蓝光度法测定壳聚糖的研究[J]. 马卫兴,朱鹏,王敏,周亚文. 食品与发酵工业. 2009(12)
[9]靛酚蓝-分光光度法测定发酵液中氨态氮含量研究[J]. 梁剑光,朱玲,徐正军. 食品与发酵工业. 2006(09)
[10]丝胶蛋白膜的制备及其物理性能[J]. 谢瑞娟,李明忠,卢神州,卢璐,吉磊. 东华大学学报(自然科学版). 2004(06)
硕士论文
[1]基于漆酶/TEMPO催化的丝胶蛋白改性及再生材料构建[D]. 张谦.江南大学 2017
[2]α-聚赖氨酸提高谷朊蛋白酶促交联及其膜材料性能的研究[D]. 孙红玉.江南大学 2015
[3]基于酶促改性的抗氧化丝素膜的制备[D]. 齐成龙.江南大学 2015
[4]蚕丝的高温高压脱胶及纯棉织物的丝胶整理[D]. 刘义绘.苏州大学 2007
本文编号：3444116
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TGase催化蛋白分子间发生转酰胺反应的途径Fig.1-1.TheproposedreactionpathwayofTGase-catalyzedacyltransferreactionsbetweenprotein
江南大学硕士学位论文102.4测试方法2.4.1丝胶蛋白溶液浓度的测定把三个具有一定规格称量瓶，放入105℃烘箱中烘干致重量不在变化，质量分别记录为w1、w2、w3。然后，往称量瓶内分别滴加VmL丝胶蛋白溶液，再次置于烘箱烘干，质量记录为w1"、w2"、w3"。丝胶蛋白溶液的浓度c采用公式（2-1）计算，三次测试结果取平均值[60]。c=w-w′V×100%(2-1)2.4.2释放氨含量的测定采用靛酚蓝法检测TGase处理过程中释氨量[61]。以氨质量浓度为1~7μg/mL硫酸铵溶液作为标准液，浓度C为横坐标，637nm处吸光度Ai为纵坐标，绘制释氨量标准曲线：Ai=0.096C+0.022，R2=0.99907。图2-1不同浓度的硫酸铵溶液中氨态氮浓度的标准曲线Fig.2-1Standardcurveofammonianitrogenconcentrationindifferentconcentrationsofammoniumsulfatesolution2.4.3氨基含量分析通过使用茚三酮法测定溶液中氨基量的变化，该方法基于甘基酸可与茚三酮反应形成蓝紫色物质[62,63]。颜色深度与溶液中氨基的量成一定比例，测定其在568nm处的吸光度相对于氨基浓度的标准曲线：Y=0.2506X+0.0171，R2=0.99647，其中Y为568nm溶液吸光度，X为甘氨酸浓度（10-5g/mL）。
第二章实验材料、仪器和方法11图2-2甘氨酸中游离氨基浓度标准曲线Fig.2-2Standardcurveofthecontentofprimaryaminesinglycine2.4.4SDS-PAGE凝胶电泳采用SDS-PAGE分析TGase处理前后丝胶的分子量变化情况[64]。测试：首先将样品溶液与上样缓冲液（4×Laemmli:2-巯基乙醇=9:1）按体积比为3:1的比例混合后，煮沸10分钟。将电泳胶安装于蛋白质凝胶电泳仪中，取将适量样品上样到8%~16%电泳胶孔内，在150V下对样品进行分离。电泳完成后，取出凝胶于Bio-SafeTMCoomassieG-250Stain中浸染1h，随后将其放在去离子水中进行脱色30min。测试中使用10~170kDa的SDS-PAGE蛋白质标准物作为分子量标记物。2.4.5体积排阻色谱（SEC）WatersE2695高效液相色谱仪可用来测试不同条件下反应后丝胶溶液的分子量变化。丝胶溶液经0.22μm的滤膜过滤后置于液相瓶中等待测试，测试条件为：进样量为10μL，流速0.5mL/min，柱温25℃。采用0.3mol/L氯化钠和50mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）作为流动相，使用Ultrahydrogellinear色谱柱（Waters，USA），2998PDADetector紫外检测器检测样品溶液在214nm处的SEC曲线。2.4.6傅里叶变换红外光谱（FTIR）通过NicoletIS10红外光谱仪（ThermoNicolet，USA）检测不同丝胶冻干膜的结构变化。采用溴化钾压片法，将样品冻干膜与溴化钾混合均匀，进行研磨压片，然后扫描32次，收集2000至500cm-1范围内的相应光谱，分辨率为4cm-1。采用OmnicV6.2和origin软件经去卷积和曲线拟合等数学方法进一步处理后，得到各样品二级结构的变化[65]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]壳聚糖在组织工程的应用[J]. 于玛丽,李丽梅,郭家智,边立功,李庆. 中国高新科技. 2019(03)
[2]壳寡糖的制备及其在医学和农业生产中的应用[J]. 原旭冰,刘洪涛,杜昱光. 生物技术进展. 2018(06)
[3]丝胶蛋白纳米纤维的研究进展[J]. 张显华,冯向伟,刘凡,王力争. 辽宁丝绸. 2017(03)
[4]丝胶蛋白的结构、性能及生物医学应用[J]. 肖肖,陈昌盛,刘伟强,张业顺. 化学进展. 2017(05)
[5]蛋白水解物水解度测定方法的研究[J]. 罗艳华,王全杰,陈沛海,高翔. 皮革与化工. 2017(02)
[6]壳聚糖的改性研究进展及其应用[J]. 王浩. 成都纺织高等专科学校学报. 2017(01)
[7]微生物谷氨酰胺转氨酶的优势结构及构效特征研究进展[J]. 李轶,范大明,黄建联,张文海,李广,赵建新. 中国食品学报. 2015(07)
[8]溴酚蓝光度法测定壳聚糖的研究[J]. 马卫兴,朱鹏,王敏,周亚文. 食品与发酵工业. 2009(12)
[9]靛酚蓝-分光光度法测定发酵液中氨态氮含量研究[J]. 梁剑光,朱玲,徐正军. 食品与发酵工业. 2006(09)
[10]丝胶蛋白膜的制备及其物理性能[J]. 谢瑞娟,李明忠,卢神州,卢璐,吉磊. 东华大学学报(自然科学版). 2004(06)
硕士论文
[1]基于漆酶/TEMPO催化的丝胶蛋白改性及再生材料构建[D]. 张谦.江南大学 2017
[2]α-聚赖氨酸提高谷朊蛋白酶促交联及其膜材料性能的研究[D]. 孙红玉.江南大学 2015
[3]基于酶促改性的抗氧化丝素膜的制备[D]. 齐成龙.江南大学 2015
[4]蚕丝的高温高压脱胶及纯棉织物的丝胶整理[D]. 刘义绘.苏州大学 2007
本文编号：3444116
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/cailiaohuaxuelunwen/3444116.html
