N端修饰对Nisin抗菌的影响及在抗菌膜中的应用
发布时间：2021-11-24 12:39
在食品的加工、贮藏、运输及消费过程中,微生物污染是引起食品腐败变质及食源性疾病的主要成因之一。乳酸链球菌素（Nisin）是一种典型、高效、安全的抗菌肽,其与氯化钠等成分复配的制剂作为防腐剂已广泛应用于食品行业。Nisin的抗菌活性与其作用基质、pH值及温度有关。如何提高nisin的抗菌活性成为当前关注的热点。本课题以nisin为研究对象,以金黄色葡萄球菌ATCC 6538为指示菌,通过抗菌实验探究N端修饰对于nisin抗菌活性的影响,并进一步表征了接枝nisin抗菌膜的性能和抗菌活性,并将其应用在复合抗菌膜中。本文研究内容和结果如下:（1）采用京尼平修饰nisin的N端,并将其进一步接枝到大分子壳聚糖上,通过抗菌实验验证接枝产物的活性。结果表明:pH的升高会显著降低nisin的抗菌活性,经过修饰后nisin仍保留抗菌活性。pH=7.2时,nisin与京尼平的交联产物抗菌活性相比nisin显著增加,而pH=6.0时其抗菌活性相比nisin略有降低。当nisin进一步通过京尼平接枝到壳聚糖上时,随着交联壳聚糖浓度的降低,接枝产物抗菌活性逐渐增强。这是由于更少的壳聚糖提供了更少的氨基位点,接...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
抗菌肽的抗菌机制[32]
姿??拧?isin一些特殊的性质来源于其独特的结构，例如硫醚环。Nisin经翻译修饰后，苏氨酸和丝氨酸残基脱水形成脱氢酪氨酸和脱氢丙氨酸，然后脱水残基结合半胱氨酸通过硫醚键形成羊毛硫氨酸环（即硫醚环），形成N端结构域和C端结构域两个刚性环状结构域[50]。乳酸乳球菌产生nisinA、nisinZ、nisinQ和nisinF，其中仅nisinA、nisinZ受到广泛研究[51]。如图1-2所示为nisinA的结构示意图，nisinA和nisinZ不同之处在于27号位置的单个氨基酸残基分别为组氨酸和天冬氨酸。与nisinA相比，nisinZ具有了更高的溶解度和扩散性[52]图1-2NisinA一级结构示意图[49]Fig.1-2SchematicofnisinAprimarystructureNisin能够抑制葡萄球菌、小球菌属、微球菌属、链球菌、乳杆菌属和结核分枝杆菌等大部分革兰氏阳性菌。由于孢子比营养细胞更敏感，产生芽孢的革兰氏阳性菌极易受到nisin作用。Nisin对革兰氏阴性菌一般无效，这是由于革兰氏阴性菌生物膜存在外膜，能够抵抗nisin干扰，降低其抗菌能力[53]。在一定条件下，如EDTA处理等，能够对细菌的外膜造成一定程度的干扰或损伤，从而增强nisin抗菌能力，抑制一些革兰氏阴性菌，如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等的生长。Nisin对蛋白酶敏感，摄入后在消化道中易被α-胰凝乳蛋白酶分解成氨基酸。由于nisin能在肠道中被无害降解，其对人体基本无毒性。通过生物学手段对nisin的细胞毒性、动物器官病毒学、血液化学、肾功能、应激反应和再生性等研究证明，nisin对人体安全无害。1.2.2Nisin的抗菌机制Nisin造成细胞膜穿孔的过程分为几个步骤[54-55]。首先，带正电的肽链与细胞膜中带负电的磷脂相互作用，使得nisin吸附在细胞膜的表面。研究结果表明，只需要膜脂中带负电组分达到一定比例而不需要膜整体带负电，nisin就能?
江南大学硕士学位论文6此外，nisin在与模型磷脂囊泡作用时，需要μM量级的浓度才能造成渗漏，而与某些菌种如链球菌，葡萄球菌等作用时，仅需nM量级的浓度就有很高的抗菌活性。这与这些菌种细胞膜上结合的lipidII有关[56]。LipidII由十一碳二烯磷酸酯、一个五肽侧链、N-乙酰葡萄糖胺多糖侧链和N-乙酰胞壁酸多糖侧链组成，是肽聚糖的合成前体，也是有效的抗菌靶点[57]。当使用尼莫拉宁阻断lipidII合成通路后，这些菌种对nisin的敏感性也降低到与模型囊泡相近的水平。图1-3Nisin在细胞膜上形成2nm的孔[51]Fig.1-3Formationof2-nmporeincellmembranebynisin1.2.3Nisin的应用限制Nisin的活性和稳定性与其作用基质、pH值和温度有关。当nisin应用在食品中时，会因为其在食品中不均匀分布或因为其与脂质等食品成分相互反应而失去活性。Nisin在较低pH条件下具有较高的溶解性和稳定性，抗菌活性维持时间较长；当其处于中性或者碱性环境中，其溶解性变差且其抑菌活性损失较快。pH=5时nisin活性损失40%，pH=9.8时活性损失超过90%。Nisin的稳定性也受温度影响，其在非低酸性环境中热稳定性较差。Nisin在pH=2.0的稀盐酸中可经受120℃高温而几乎不损失活性，但随着pH的提高，高温环境会增加nisin的活性损失率[58]。研究表明，nisin氨基酸序列中不饱和氨基酸如DHA3、DHA5和DHB2的不完整性使得其活性随着作用基质pH和温度的变化而严重损失，因此使用时应该尽量避免高温并保持较低pH值[59]。低pH值时，其DHA双键与水分子结合，生成相应的氨基化合物和酮酸，其抗菌活性不受影响；高pH值时，其分子间易发生亲核加成反应，且分子内部残基易发生反应生成多分子聚合物，溶解度和抗菌活性降低[60]。1.2.4提高nisin抗菌活性和稳定性的方法由于上述nisin的应用
【参考文献】：
期刊论文
[1]食源性致病微生物研究的新动态[J]. 施春雷. 食品安全质量检测学报. 2019(18)
[2]全球关注:重视抗生素发展与耐药风险的对策[J]. 刘昌孝. 中国抗生素杂志. 2019(01)
[3]抗菌包装材料及其在食品包装领域的研究进展[J]. 王洪江,宋雪健,李志江,张东杰. 黑龙江八一农垦大学学报. 2018(04)
[4]京尼平交联乳清蛋白和壳聚糖膜的制备[J]. 李媛,吕佳,徐雨春,薛海燕. 农产品加工. 2017(21)
[5]Nisin对奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成的影响及调节机制[J]. 许女,史改玲,张浩,杜立红,王俊东. 中国食品学报. 2017(10)
[6]壳聚糖/聚赖氨酸对柑橘的保鲜性研究[J]. 叶青青,李亚娜,候温甫. 包装工程. 2017(17)
[7]水产品中6类抗生素抗性基因和Ⅰ类整合子的定量检测[J]. 王慧平,闫鹤,赵俊仁,石磊. 现代食品科技. 2017(05)
[8]复合型可食用膜的研究进展[J]. 左贯杰,陈复生,张丽芬,宋小勇,杜振亚. 食品工业. 2016(11)
[9]抗菌肽在水产动物饲料中的应用研究进展[J]. 于世亮,王裕玉,徐中玉,石野,车建芳,杨雨虹. 中国饲料. 2014(08)
[10]抗菌肽的研究进展及其应用[J]. 李冠楠,夏雪娟,隆耀航,李姣蓉,武婧洁,朱勇. 动物营养学报. 2014(01)
博士论文
[1]微纳颗粒与磷脂的相互作用研究及其应用[D]. 陆乃彦.南京大学 2013
[2]黄鲫（Setipinna taty）蛋白抗菌肽的制备及抗菌作用等生物活性研究[D]. 宋茹.中国海洋大学 2011
硕士论文
[1]壳聚糖微球的制备、改性及应用研究[D]. 许可.武汉科技大学 2019
[2]可食性壳聚糖-大豆分离蛋白抑菌膜的研制[D]. 张小涵.沈阳农业大学 2019
[3]大豆蛋白交联玉米淀粉/Nano-TiO2包装膜的制备及圣女果保鲜应用[D]. 阴彤彤.东北农业大学 2019
[4]丝素表面接枝多肽对酶促改性效果的影响[D]. 朱雪珂.江南大学 2017
[5]京尼平、戊二醛或EDC/NHS的交联对构建胶原/壳聚糖真皮支架的作用[D]. 封占增.浙江大学 2014
[6]食品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法研究[D]. 张超楠.吉林大学 2012
[7]小麦醇溶蛋白膜的制备与性能研究[D]. 李凌芳.浙江大学 2008
[8]胶原—壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架的制备及其在组织工程皮肤构建中的应用[D]. 孙锦章.浙江大学 2007
本文编号：3516001
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
抗菌肽的抗菌机制[32]
姿??拧?isin一些特殊的性质来源于其独特的结构，例如硫醚环。Nisin经翻译修饰后，苏氨酸和丝氨酸残基脱水形成脱氢酪氨酸和脱氢丙氨酸，然后脱水残基结合半胱氨酸通过硫醚键形成羊毛硫氨酸环（即硫醚环），形成N端结构域和C端结构域两个刚性环状结构域[50]。乳酸乳球菌产生nisinA、nisinZ、nisinQ和nisinF，其中仅nisinA、nisinZ受到广泛研究[51]。如图1-2所示为nisinA的结构示意图，nisinA和nisinZ不同之处在于27号位置的单个氨基酸残基分别为组氨酸和天冬氨酸。与nisinA相比，nisinZ具有了更高的溶解度和扩散性[52]图1-2NisinA一级结构示意图[49]Fig.1-2SchematicofnisinAprimarystructureNisin能够抑制葡萄球菌、小球菌属、微球菌属、链球菌、乳杆菌属和结核分枝杆菌等大部分革兰氏阳性菌。由于孢子比营养细胞更敏感，产生芽孢的革兰氏阳性菌极易受到nisin作用。Nisin对革兰氏阴性菌一般无效，这是由于革兰氏阴性菌生物膜存在外膜，能够抵抗nisin干扰，降低其抗菌能力[53]。在一定条件下，如EDTA处理等，能够对细菌的外膜造成一定程度的干扰或损伤，从而增强nisin抗菌能力，抑制一些革兰氏阴性菌，如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等的生长。Nisin对蛋白酶敏感，摄入后在消化道中易被α-胰凝乳蛋白酶分解成氨基酸。由于nisin能在肠道中被无害降解，其对人体基本无毒性。通过生物学手段对nisin的细胞毒性、动物器官病毒学、血液化学、肾功能、应激反应和再生性等研究证明，nisin对人体安全无害。1.2.2Nisin的抗菌机制Nisin造成细胞膜穿孔的过程分为几个步骤[54-55]。首先，带正电的肽链与细胞膜中带负电的磷脂相互作用，使得nisin吸附在细胞膜的表面。研究结果表明，只需要膜脂中带负电组分达到一定比例而不需要膜整体带负电，nisin就能?
江南大学硕士学位论文6此外，nisin在与模型磷脂囊泡作用时，需要μM量级的浓度才能造成渗漏，而与某些菌种如链球菌，葡萄球菌等作用时，仅需nM量级的浓度就有很高的抗菌活性。这与这些菌种细胞膜上结合的lipidII有关[56]。LipidII由十一碳二烯磷酸酯、一个五肽侧链、N-乙酰葡萄糖胺多糖侧链和N-乙酰胞壁酸多糖侧链组成，是肽聚糖的合成前体，也是有效的抗菌靶点[57]。当使用尼莫拉宁阻断lipidII合成通路后，这些菌种对nisin的敏感性也降低到与模型囊泡相近的水平。图1-3Nisin在细胞膜上形成2nm的孔[51]Fig.1-3Formationof2-nmporeincellmembranebynisin1.2.3Nisin的应用限制Nisin的活性和稳定性与其作用基质、pH值和温度有关。当nisin应用在食品中时，会因为其在食品中不均匀分布或因为其与脂质等食品成分相互反应而失去活性。Nisin在较低pH条件下具有较高的溶解性和稳定性，抗菌活性维持时间较长；当其处于中性或者碱性环境中，其溶解性变差且其抑菌活性损失较快。pH=5时nisin活性损失40%，pH=9.8时活性损失超过90%。Nisin的稳定性也受温度影响，其在非低酸性环境中热稳定性较差。Nisin在pH=2.0的稀盐酸中可经受120℃高温而几乎不损失活性，但随着pH的提高，高温环境会增加nisin的活性损失率[58]。研究表明，nisin氨基酸序列中不饱和氨基酸如DHA3、DHA5和DHB2的不完整性使得其活性随着作用基质pH和温度的变化而严重损失，因此使用时应该尽量避免高温并保持较低pH值[59]。低pH值时，其DHA双键与水分子结合，生成相应的氨基化合物和酮酸，其抗菌活性不受影响；高pH值时，其分子间易发生亲核加成反应，且分子内部残基易发生反应生成多分子聚合物，溶解度和抗菌活性降低[60]。1.2.4提高nisin抗菌活性和稳定性的方法由于上述nisin的应用
【参考文献】：
期刊论文
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[7]水产品中6类抗生素抗性基因和Ⅰ类整合子的定量检测[J]. 王慧平,闫鹤,赵俊仁,石磊. 现代食品科技. 2017(05)
[8]复合型可食用膜的研究进展[J]. 左贯杰,陈复生,张丽芬,宋小勇,杜振亚. 食品工业. 2016(11)
[9]抗菌肽在水产动物饲料中的应用研究进展[J]. 于世亮,王裕玉,徐中玉,石野,车建芳,杨雨虹. 中国饲料. 2014(08)
[10]抗菌肽的研究进展及其应用[J]. 李冠楠,夏雪娟,隆耀航,李姣蓉,武婧洁,朱勇. 动物营养学报. 2014(01)
博士论文
[1]微纳颗粒与磷脂的相互作用研究及其应用[D]. 陆乃彦.南京大学 2013
[2]黄鲫（Setipinna taty）蛋白抗菌肽的制备及抗菌作用等生物活性研究[D]. 宋茹.中国海洋大学 2011
硕士论文
[1]壳聚糖微球的制备、改性及应用研究[D]. 许可.武汉科技大学 2019
[2]可食性壳聚糖-大豆分离蛋白抑菌膜的研制[D]. 张小涵.沈阳农业大学 2019
[3]大豆蛋白交联玉米淀粉/Nano-TiO2包装膜的制备及圣女果保鲜应用[D]. 阴彤彤.东北农业大学 2019
[4]丝素表面接枝多肽对酶促改性效果的影响[D]. 朱雪珂.江南大学 2017
[5]京尼平、戊二醛或EDC/NHS的交联对构建胶原/壳聚糖真皮支架的作用[D]. 封占增.浙江大学 2014
[6]食品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法研究[D]. 张超楠.吉林大学 2012
[7]小麦醇溶蛋白膜的制备与性能研究[D]. 李凌芳.浙江大学 2008
[8]胶原—壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架的制备及其在组织工程皮肤构建中的应用[D]. 孙锦章.浙江大学 2007
本文编号：3516001
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