基于新型纳米材料与核酸酶的传感器在生物分析中的应用
发布时间：2021-12-11 17:39
背景蛋白质和核酸检测对于病原感染、遗传疾病、法医分析和现代生命科学的发展至关重要。但是,生物分析往往目标物含量少、杂质多,因而开发新型的高灵敏检测手段十分必要。纳米材料具有独特的光学性质和良好的生物相容性因而广泛应用于生物分析中。核酸酶是能够将核酸链的磷酸二酯键切断的酶,常作为一种重要的工具用于生物分析中。本研究通过新型的纳米材料核酸酶的DNA末端保护技术和信号放大技术构建了背景低、特异性好、灵敏度高的核酸与蛋白质检测的新方法。目的（1）构建基于阳离子共轭聚合物和外切酶Ⅰ的荧光检测方法用于蛋白质检测及细胞成像,实现链霉亲和素和叶酸受体的检测以及HeLa荧光成像;（2）构建基于核酸外切酶Ⅲ及MoS2纳米片荧光猝灭性能的DNA双重信号放大检测方法,实现人血色素沉着症基因的检测。方法（1）链霉亲和素（Strepavidin,SA）和生物素可以通过特异性结合,从而阻止探针核酸P1被核酸外切酶Ⅰ（Exonuclease Ⅰ,Exo Ⅰ）的消化,带正电荷的阳离子荧光共轭聚合物（Polymer poly（9,9-bis（6’-N,N,Ntrimethylammonium）hex...
【文章来源】：新乡医学院河南省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
制备的PFP的FTIR光谱（A）和Zeta电位（B）
新乡医学院硕士学位论文9以具有较高荧光量子产率的PFP（Ex:370nm,Em:425nm）为能量供体。选择最大吸收在490nm处，发射在530nm处的FAM标记P1为受体，因为其吸收与PFP的特征发射重叠（425nm，图1.3）。在没有SA的情况下，P1被ExoI从3’端依次消化水解成单核苷酸。而由于单核苷酸与PFP之间的静电相互作用相对较弱，导致FAM远离PFP，FRET很难发生。当SA存在时，SA和生物素的高度结合阻止了P1被ExoI消化，这是由于蛋白质-配体特异性相互作用产生了显著的空间位阻。随后，带正电荷的PFP通过静电相互作用靠近P1，使得从PFP到FAM发生FRET，在530nm处检测到增强的荧光发射。因此，通过检测FAM和PFP的FRET比值（I530/I425）来实现目标检测。FRET比值与SA的浓度成正比。图1.1制备的PFP的FTIR光谱（A）和Zeta电位（B）。Fig.1.1FTIRspectrum(A)andzetapotential(B)oftheas-preparedPFP.图1.2基于阳离子共轭聚合物和外切酶I的蛋白质检测原理图。Fig.1.2SchematicdiagramofproteindetectionbasedoncationicconjugatedpolymerandExoI.
新乡医学院硕士学位论文10图1.3PFP(abs,a;em,b)和P1(abs,c;em,d)的吸光度和荧光光谱。Fig.1.3AbsorbanceandfluorescencespectraofPFP(Abs,a;Em,b)andP1(Abs,c;Em,d).1.3.2方法的可行性分析首先通过凝胶电泳验证SA对P1的末端保护。如图1.4A所示，只有P1时有一个非常明显的条带（泳道1），在加入ExoI后（泳道2）条带消失。这表明ExoI能够有效地消化水解P1。在没有ExoI的情况下，将P1与SA混合，观察到两个条带发生不同的条带迁移（泳道3），这归因于P1和SA的结合。当P1与SA结合后加入ExoI时，仍然检测到条带迁移（泳道4）。这证明SA-P1复合物能保护P1使其免受ExoI消化。测量了不同条件下FRET的荧光强度，验证了该方法的可行性。相应的荧光光谱如图1.4B所示。在发射波长530nm、激发波长370nm处，P1表现出很弱的荧光强度（曲线a）。在P1溶液中加入PFP，在425nm处和530nm处可以明显观察到PFP和FAM的荧光信号（曲线b）。结果证实，P1通过强静电力与PFP结合，并导致从PFP到FAM发生有效的FRET。然而，在加入PFP之前随着ExoI和P1的混合，在没有SA的情况下，530nm处的荧光强度显著降低（曲线c）。这一现象表明ExoI催化消化P1产生单核苷酸，导致PFP和FAM之间的FRET效率低下。而P1与SA混合，然后加入ExoI和PFP，结果PFP在425nm处的荧光强度降低，530nm处荧光强度明显增强（曲线d）。表明生物素与SA的特异性结合抑制ExoI消化P1并产生有效的FRET。上述结果表明，该方法可用于蛋白质分析。
本文编号：3535103
【文章来源】：新乡医学院河南省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
制备的PFP的FTIR光谱（A）和Zeta电位（B）
新乡医学院硕士学位论文9以具有较高荧光量子产率的PFP（Ex:370nm,Em:425nm）为能量供体。选择最大吸收在490nm处，发射在530nm处的FAM标记P1为受体，因为其吸收与PFP的特征发射重叠（425nm，图1.3）。在没有SA的情况下，P1被ExoI从3’端依次消化水解成单核苷酸。而由于单核苷酸与PFP之间的静电相互作用相对较弱，导致FAM远离PFP，FRET很难发生。当SA存在时，SA和生物素的高度结合阻止了P1被ExoI消化，这是由于蛋白质-配体特异性相互作用产生了显著的空间位阻。随后，带正电荷的PFP通过静电相互作用靠近P1，使得从PFP到FAM发生FRET，在530nm处检测到增强的荧光发射。因此，通过检测FAM和PFP的FRET比值（I530/I425）来实现目标检测。FRET比值与SA的浓度成正比。图1.1制备的PFP的FTIR光谱（A）和Zeta电位（B）。Fig.1.1FTIRspectrum(A)andzetapotential(B)oftheas-preparedPFP.图1.2基于阳离子共轭聚合物和外切酶I的蛋白质检测原理图。Fig.1.2SchematicdiagramofproteindetectionbasedoncationicconjugatedpolymerandExoI.
新乡医学院硕士学位论文10图1.3PFP(abs,a;em,b)和P1(abs,c;em,d)的吸光度和荧光光谱。Fig.1.3AbsorbanceandfluorescencespectraofPFP(Abs,a;Em,b)andP1(Abs,c;Em,d).1.3.2方法的可行性分析首先通过凝胶电泳验证SA对P1的末端保护。如图1.4A所示，只有P1时有一个非常明显的条带（泳道1），在加入ExoI后（泳道2）条带消失。这表明ExoI能够有效地消化水解P1。在没有ExoI的情况下，将P1与SA混合，观察到两个条带发生不同的条带迁移（泳道3），这归因于P1和SA的结合。当P1与SA结合后加入ExoI时，仍然检测到条带迁移（泳道4）。这证明SA-P1复合物能保护P1使其免受ExoI消化。测量了不同条件下FRET的荧光强度，验证了该方法的可行性。相应的荧光光谱如图1.4B所示。在发射波长530nm、激发波长370nm处，P1表现出很弱的荧光强度（曲线a）。在P1溶液中加入PFP，在425nm处和530nm处可以明显观察到PFP和FAM的荧光信号（曲线b）。结果证实，P1通过强静电力与PFP结合，并导致从PFP到FAM发生有效的FRET。然而，在加入PFP之前随着ExoI和P1的混合，在没有SA的情况下，530nm处的荧光强度显著降低（曲线c）。这一现象表明ExoI催化消化P1产生单核苷酸，导致PFP和FAM之间的FRET效率低下。而P1与SA混合，然后加入ExoI和PFP，结果PFP在425nm处的荧光强度降低，530nm处荧光强度明显增强（曲线d）。表明生物素与SA的特异性结合抑制ExoI消化P1并产生有效的FRET。上述结果表明，该方法可用于蛋白质分析。
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