核壳结构磁性纳米球的制备及其在蛋白分离纯化中的应用

发布时间：2017-07-18 14:00

  本文关键词：核壳结构磁性纳米球的制备及其在蛋白分离纯化中的应用

  更多相关文章： 磁性纳米微球 核壳结构 Ni-NTA 蛋白分离纯化

【摘要】：随着基因组学、蛋白质组学的发展以及蛋白在治疗学中的应用,人们对于融合蛋白的需求日益增加。高效的蛋白分离纯化手段也因而倍受青睐。磁性纳米球(MNPs)由于巨大的比表面积、良好的分散性、大小可控、独一无二的磁响应性、易于分离等特点,在生物医学领域广泛应用。与目前商业用的微米级的磁珠相比,磁性纳米球分离蛋白的效率高,非特异性吸附少,但是容易聚集,稳定性差,甚至在复杂样本中失去磁性,严重限制了它们的应用。因此,很有必要开发一种稳定性高,分散性好、分离效率高而且能抵抗非特异性蛋白吸附的磁性纳米球。本文研究内容包括两部分:第一部分,核壳结构磁性纳米球的制备。首先,通过溶剂热法合成了大小均一的Fe_3O_4 MNPs,平均粒径185 nm;其次,通过Stober法对Fe_3O_4MNPs进行包硅,提高Fe_3O_4 MNPs的化学稳定性,所得Fe_3O_4@SiO_2 MNPs粒径约245nm;然后,通过蒸馏沉淀聚合的方法,在Fe_3O_4@SiO_2 MNPs表面修饰聚合物PHEMA;接着,为了改善Fe_3O_4@SiO_2@PHEMA MNPs水分散性,对聚合物刷进行衍生化,接枝丁二酸酐、EDC/NHS活化羧基、NTA酰化,最终获得单分散亲水性Fe_3O_4@SiO_2@PHEMA-SA-NTA MNPs,水化半径为255 nm,饱和磁化值为18.58emug~(-1),金属离子Ni~(2+)的螯合量为34.37μg/mg。第二部分,磁性纳米球分离纯化蛋白的应用研究。我们利用BSA上的组氨酸基团模拟His-tag与Fe_3O_4@SiO_2@PHEMA-SA-NTA-Ni~(2+)MNPs之间的作用,经考马斯亮蓝法测定蛋白负载量为124.87μg/mg;用正常HepG2细胞蛋白考察其抗非特异性蛋白吸附的能力,用稳转细胞系His-CAV1-HepG2细胞蛋白考察其分离纯化His-tagged CAV1融合蛋白的性能,SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹结果表明Fe_3O_4@SiO_2@PHEMA-SA-NTA-Ni~(2+)MNPs具备一定的抗非特异性蛋白吸附作用和特异性分离富集His-tagged蛋白的能力。
【关键词】：磁性纳米微球 核壳结构 Ni-NTA 蛋白分离纯化
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TB383.1;TQ936
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 1 引言10-26
• 1.1 蛋白分离纯化10-11
• 1.2 磁亲和分离技术11-12
• 1.3 磁性纳米微球的制备12-21
• 1.3.1 共沉淀法14-15
• 1.3.2 雾化蒸发法15-16
• 1.3.3 热分解法16-18
• 1.3.4 还原法18
• 1.3.5 溶胶凝胶法18-19
• 1.3.6 水热法/溶剂热法19-20
• 1.3.7 微乳法20-21
• 1.4 磁性纳米微球的功能化修饰21-25
• 1.4.1 生物相容性无机物21-22
• 1.4.2 配体交换22-23
• 1.4.3 包封和自组装23-24
• 1.4.4 多功能配体24-25
• 1.5 本论文的研究意义及主要内容25-26
• 2 核壳结构纳米球的制备及表征26-38
• 2.1 实验部分27-30
• 2.1.1 实验试剂27-28
• 2.1.2 实验仪器28
• 2.1.3 Fe_3O_4 MNPs的合成28
• 2.1.4 Fe_3O_4 MNPs的修饰28-30
• 2.2 测试与表征30-31
• 2.2.1 透射电子显微镜30
• 2.2.2 粒径分布及Zeta电位测定30
• 2.2.3 傅里叶变换红外光谱（FTIR）测试30
• 2.2.4 热失重分析(TGA)30-31
• 2.2.5 水分散性及磁性初步考察31
• 2.2.6 磁性强度检测31
• 2.3 试验结果与分析31-37
• 2.3.1 TEM结果31-32
• 2.3.2 粒径分布及Zeta电位结果32-34
• 2.3.3 FITC-IR测试结果34-35
• 2.3.4 TGA测试结果35-36
• 2.3.5 水中分散性及磁性照片36-37
• 2.3.6 磁性测试结果37
• 2.4 本章小结37-38
• 3 核壳结构磁性纳米球分离纯化蛋白的应用研究38-58
• 3.1 实验部分39-47
• 3.1.1 实验试剂39
• 3.1.2 实验仪器39-40
• 3.1.3 MNPs上金属离子螯合量测定40-41
• 3.1.4 MNPs蛋白洗脱条件的考察41
• 3.1.5 MNPs蛋白结合能力的考察41-43
• 3.1.6 细胞培养和转染43
• 3.1.7 细胞蛋白提取及定量43-44
• 3.1.8 MNPs抗非特异性吸附能力考察44-46
• 3.1.9 MNPs特异性富集分离蛋白能力考察46-47
• 3.1.10 MNPs的重复利用性考察47
• 3.2 试验结果与分析47-55
• 3.2.1 MNPs的金属离子螯合量47-48
• 3.2.2 MNPs上蛋白洗脱条件48-50
• 3.2.3 MNPs的蛋白负载量50-51
• 3.2.4 细胞蛋白定量51-52
• 3.2.5 MNPs抗非特异性蛋白吸附结果52-53
• 3.2.6 MNPs特异性富集分离蛋白结果53-55
• 3.2.7 MNPs的重复利用性55
• 3.3 本章小结55-58
• 总结与展望58-60
• 参考文献60-68
• 攻读学位期间已完成工作68-70
• 致谢70-71

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本文编号：557995